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GST pull-down assay 　　GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术,近年来越来越受到广大学者的青睐。其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白” 目的蛋白 ,洗脱结合物后通过SDS电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行,操作方便。 GST pull-down技术 GST：谷胱甘肽巯基转移酶 glutathione S-transferase 4 诱导适当时间后，4℃，5000g离心10min后弃上清。（如需要该步沉淀能保存在-80℃） 5 重悬沉淀：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬 6 冰上超声沉淀重悬液：2S 间隔1S 至悬液透明（ 一般可容性蛋白：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬液超声６～９min可透明） 7 10,000g*10min离心上清转移至新的离心管，加DTT至终浓度1mmol/L 二 谷胱甘肽-琼脂糖树脂的处理 1 轻轻颠倒树脂盛装容器，混成匀浆 2 取适量匀浆放入离心管中，4℃，500g离心5min后弃上清（每10ml 细菌培养物可以用50ul匀浆） 3 每1.33mL 初始匀浆加入10 mL 4℃预冷的PBS，颠倒混匀后，4℃，500g离心5min后弃上清（ 50ul初始匀浆用400ulPBS洗） 4 每1.33mL 初始匀浆加入1 mL 冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒混匀置冰上放置待用。（ 50ul初始匀浆加入40ulPBS） 三 结合GST蛋白 1 上清与适量50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，4℃轻摇30min（可过夜让其充分结合）。 2 4℃，500g离心5min后弃上清 3 沉淀加入10倍床柱体积PBS（1床柱体积 0.5*50%匀浆体积） 50ul初始匀浆用400ulPBS洗），颠倒混匀以洗去未与树脂结合的杂蛋白（每次可在混旋仪上混匀５min 4 4℃，５00g离心5min后弃上清 5 重复步骤3和4两次，共三次 四 预清除细胞裂解液 1 将细胞裂解液与50ul的和GST结合的50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂悬液在4℃翻转混合孵育2h。（需要检测相互作用的裂解液的量是高度可变的。开始用相当于1*106~1*107个细胞的裂解液。） 2 离心，4℃，13，000rpm *2min 3 将上清转移到新的离心管中 五 探测细胞裂解液 1 设定两个等量预清除的细胞裂解液分别加入到结合GST和GST-X蛋白的谷胱甘肽-琼脂糖树脂中，4℃翻转混合孵育2h（时间可适当延长，如过夜以让其充分结合） 2 离心，4℃，13，000rpm *2min 3 用1ml冰冷的细胞裂解液洗涤，4℃，13，000rpm *2min，弃上清，重复洗三次 4 加入50ul的2*Loading Buffer。轻弹混匀，沸水煮5~10min，离心后收集上清。 SDS分离相互作用蛋白 Western-Blot检测靶蛋白