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GST pull-down assay GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术,近年来越来越受到广大学者的青睐。其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白” 目的蛋白 ,洗脱结合物后通过SDS电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行,操作方便。 GST pull-down技术 GST：谷胱甘肽巯基转移酶 glutathione S-transferase pull-down技术就是先将待研究相互作用的一组蛋白中的一个（A）固定在固相上，然后将另一待研究的蛋白（B）作为流动相通过固相，然后洗脱下来后用B抗体去杂交，如果能杂交出来，那说明B可以和A相互作用。GST Pull-down实验技术 谷胱甘肽巯基转移酶 Glutathione S-transferase GST Pull-down实验技术是用来鉴定蛋白间相互作用的体外实验技术之一。 该技术的原理是，首先构建靶蛋白和GST的融合基因，导入细胞中表达出相应的 融合蛋白，然后提取靶蛋白-GST融合蛋白，并将其固定在谷胱甘肽亲和树脂上后充当一种“诱饵蛋白”，将含有目的蛋白的溶液过柱，利用亲和层析纯化目的蛋白，从而在目的蛋白溶液中捕获与之相互作用的“捕获蛋白” 目的蛋白 ，这种结合物经过梯度洗脱后通过SDS电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白。“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。GST亲和层析和GST Pull-down方法基本原理是：利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。在病毒受体研究中，融合蛋白通常设计为病毒吸附蛋白（VAP）。这方面成功的例子有HBV[28]。具体做法如下：将GST-融合探针蛋白（VAP）和GTH-Sepharose制成亲和层析柱，然后待分析的蛋白质混合液流经亲和层析柱，梯度洗脱，分离、收集各蛋白组分，这称为GST亲和柱层析（GST affinity column chromatography）。如果一开始待检蛋白就和GST- 融合探针蛋白与GTH-Sepharose一起共同孵育，经离心收集洗脱复合物和洗涤后，再加入过量GTH获得相互作用蛋白的复合物，那么这种方法则称为GST pull down。 GST亲和层析及相应的GST Pull-down方法的优点是敏感，对混合物中的所有蛋白均“一视同仁”， 也可用于受体功能的鉴定。缺点是GST有可能影响融合蛋白的空间结构，另外，蛋白质浓度对实验也有一定影响。 酵母双杂交技术：许多真核生物的转录激活因子通常具有两个可独立存在的结构域，即DNA结合域（BD）与转录激活域（AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域。不同来源的激活因子的BD区与AD结合后则可特异地激活被BD结合的基因表达。基于这个原理，人们将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用就会使AD与BD形成完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。 酵母双杂交系统由三个部分组成：与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白（bait）；AD融合的蛋白表达载体，其表达的蛋白称靶蛋白（prey）；带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3、URA3、LacZ和ADE2等。而菌株则具有相应的营养缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因，有利于杂交质粒的鉴定与分离。根据目前通用系统中BD来源主要分为GAL4系统和LexA系统。后者因BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。近年来，开始出现了应用酵母双杂交技术进行病毒受体研究的成功报告，如麻疹病毒的绒猴细胞受体。李凌云等构建了表达“猎物”（prey）蛋白的质粒和表达病毒VAP“诱饵”（bait）蛋白的质粒，然后共转染同一酵母细胞，利用已建立的易感细胞cDNA文库，筛到了阳性克隆。酵母双杂交技术的优点是灵敏度高，特异性较 好，缺点是容易出现假阳性和假阴性，而且对蛋白质在细