我国梨腐烂病病原菌的初步鉴定及序列分析.docVIP

我国梨腐烂病病原菌的初步鉴定及序列分析 摘 要：【目的】为了对我国梨腐烂病病原菌进行初步鉴定和序列分析，【方法】从我国15个省（市）梨产区采集腐烂病样品并观察其田间危害症状，通过组织分离法分离获得168份梨腐烂病菌分离株，从中选取72份进行单孢纯化，共获得79份梨腐烂病菌纯化分离株；观察在PDA、25 ℃黑暗条件下病原菌菌落形态以及产孢体形态，并对其在梨枝条上产生的分生孢子器徒手切片置显微镜下观察其结构特征和分生孢子形态；采用菌丝块接种法测定梨腐烂病菌在‘翠冠’梨离体枝条上的致病力。对部分菌株rDNA-ITS进行PCR扩增、测序，利用BLAST软件与GenBank数据库进行序列相似性分析，并用MEGA 4.1和邻接法构建系统发育树。【结果】根据梨腐烂病菌各分离株在PDA上的菌落形态特征可分为Ⅰ型和Ⅱ型两种菌落类型，不同梨腐烂病菌分离株在PDA上产生多种类型的产孢体，不同梨腐烂病菌菌株在离体梨树枝条上的致病力存在差异，我国梨腐烂病菌的rDNA-ITS核苷酸序列一致率为99.98%～100%，与苹果腐烂病菌分别聚在同一亚组的两个分支。【结论】我国梨腐烂病病原菌存在不同的菌落类型，其rDNA-ITS核苷酸序列分析显示均为V. mali var. pyri。 关键词： 梨腐烂病； 苹果腐烂病； rDNA-ITS； 致病力 中图分类号：S661.2 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪01-0140-07 梨腐烂病（Valsa canker of pear）又名烂皮病，主要危害梨树的主枝和侧枝，导致梨树势衰弱，果实产量和品质下降。该病具有发生区域广、发病率高、难以控制的特点。在我国梨主产区均有发生，尤以新疆、西北、华北、东北等地发生严重[1]。发病严重的梨园，树体病疤累累、枝干残缺不全，造成大量死树或毁园。目前国内外对梨腐烂病病原菌种类及其归属尚未十分明确，起初，我国学者根据病原菌的形态学特征鉴定为梨黑腐皮壳菌[Valsa ambiens （Pers.） Fr.][2-3]，后来通过比较其与苹果腐烂病菌形态学性状以及酯酶同工酶谱和致病性方面的异同，认为梨腐烂病菌是苹果黑腐皮壳梨变种（Valsa mali var. pyri）[4]。日本学者Kobavashi[5]认为V. mali与V. ceratosperma是同一种菌的两个异名。在很长的一段时间内，V. mali和V. ceratosperma 均被用作梨和苹果腐烂病菌的名称[6-9]，之后更多采用V. ceratosperma。王旭丽等[10]通过对病菌的ITS序列测定分析并结合培养特征鉴定认为，梨腐烂病菌和苹果腐烂病菌可统称为V. ceratosperma。WANG等[11]认为V. mali是引起我国梨腐烂病和苹果腐烂病的主要病原菌，V. mali中又分为两个变种，梨腐烂病菌为V. mali var. pyri，它既可以引起梨腐烂病也可以引起苹果腐烂病；苹果腐烂病菌为V. mali var. mali，它则主要是引起苹果腐烂病。此外苹果腐烂病的病原除了V. mali外，还发现少部分为V. malicola。 研究通过对我国梨产区梨腐烂病的调查、采集、分离获得梨腐烂病菌分离株，对其进行生物学特性的观察、致病力的鉴定、测定并分析其rDNA-ITS基因序列，分析我国梨腐烂病病原菌分离株的生物学特性与其基因组rDNA-ITS基因序列是否存在相关性，我国梨腐烂病菌不同分离株致病力的差异与寄主种类及地理来源之间是否存在相关性，旨在明确我国梨腐烂病病原菌的种类组成。 1 材料和方法 1.1 材料 2010年5月至2012年5月，依托于国家梨产业技术体系21个综合试验站，根据梨树腐烂病在田间的病害症状特征，在我国15个省市（黑龙江、辽宁、吉林、新疆、河北、北京、山西、陕西、甘肃、山东、河南、湖北、安徽、福建、云南）的梨产区采集梨腐烂病病样，共分离获得168份梨腐烂病菌株（表1）。另从山西苹果树腐烂病病样上共分离获得7份苹果腐烂病菌株作为参照菌株。 1.2 方法 1.2.1 病原菌株的分离、纯化 采用常规组织分离法[12]，从病斑边缘病健交界处取样分离、培养获得梨腐烂病菌分离株。选取不同省份部分分离株在25 ℃、黑暗条件下于PDA平板上进行培养至产生分生孢子角，挑取分生孢子角制备孢子悬浮液涂于PDA平板上培养，孢子膨大后挑取单孢置于新的PDA平板上培养获得纯化菌株[13]，将纯化菌株保存于PDA斜面试管中，于4 ℃贮存备用。所有病样及菌种保存于华中农业大学果树脱毒种质资源室内保存中心。 1.2.2 病原菌株形态观察 将接种不同纯化分离株的PDA平板置于25 ℃、黑暗条件进行培养， 观察菌落的颜色、形状、气生菌丝的疏密程度和产孢体的形态特征，记录产孢体的大小及分布情况。将