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微孔板法测定功能性饮料中的维生素B12 　　摘 要： 　　通过样品处理比较试验、色素影响评价、回收率试验和重复性试验，得到了微孔板法测定功能性饮料中维生素B12的有效方法。经测定，该方法测定限可达到0.005 μg/L，1.0、2.0、20.0 μg/L三个梯度水平的加标回收率为94.4%～101.8%，实际样品测定中相对标准偏差为0.35%～4.34%（n=6），灵敏度和重复性很高，可用于测定功能性饮料中微量的维生素B12。 　　关键词：微孔板法；测定；功能性饮料；维生素B12 　　中图分类号：TS275.4+TS207.3 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）04-0110-04 　　功能性饮料是应特定人群的营养需求，通过添加维生素、矿物质等功能因子制作的饮品，属于特殊用途饮料类[1]，具有一定的保健功能。功能性饮料常添加各种维生素，如：烟酰胺、肌醇、维生素B6、维生素B12等[2，3]。其中，维生素B12能促进红细胞形成，参与人体内碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢，可维护人体神经系统的正常功能[4，5]，是功能性饮料中经常添加、极为重要的有效成分之一。 　　维生素B12测定方法主要有酶联免疫吸附法、化学分析法和微生物法[6]。维生素B12在功能饮料中的添加量通常为0.8～20.0 μg/L，酶联免疫吸附法（检测限3.9 μg/kg）[7]、高效液相色谱-紫外法（检测限1.0～4.4 μg/kg）[8，9]等化学分析法很难准确测定其含量；而原子吸收分光光度法（检测限5.0 ng/L）[10]、高效液相色谱-荧光光度法（检测限0.1 μg/L）[11]虽然有较高的灵敏度，但往往因功能性饮料基质复杂，样品净化难监控，对仪器测定干扰大，从而影响维生素B12的测定结果[6]。 　　微生物测定法灵敏度高，检测限可达到0.01 μg/L[12]，是进行微量维生素B12测定的理想方法。但微生物法操作繁琐、耗时长[6]，且实验重现性受微生物菌株活力、所用器皿清洁度、试验人员操作的影响较大[13，14]，亟需现代化的手段加以改善，以便广泛应用。为此，本试验用与现行国家标准测试原理相同的维生素B12测定试剂盒对功能性饮料中的维生素B12进行测定[15]，并通过试验对其前处理方法、准确性、精密度进行评定。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料与试剂 　　试样为5种市售功能性饮料，维生素B12标识质量浓度分别为0.8、1.0、11.0、12.0、20.0 μg/L；维生素B12测定试剂盒[包括莱士曼氏乳酸杆菌（Lactobacillus leichmannii）包被的96孔微孔板、维生素B12标准品干粉、测试用培养基干粉、无菌蒸馏水、微孔板架]，德国IFP公司；微量移液器（100、200 μL及1 mL），德国Eppendorf公司；0.2 μm水相滤膜。 　　1.2 仪器与设备 　　xMark型酶标仪，美国Bio-Rad公司（精度0.001）；SHP-250型生化培养箱，上海精宏实验设备有限公司[（36±0.5）℃]；超净工作台，北京东联哈尔仪器公司；SX-500型高压蒸汽灭菌锅，日本TOMY公司；水浴锅。 　　1.3 方法 　　1.3.1 测试用培养基的配制 在维生素B12测试用培养基贮存瓶中加入10 mL无菌水，密封混匀后95℃水浴5 min，期间振荡混匀2次。水浴后迅速冷却至室温，用无菌滤膜过滤后备用。 　　1.3.2 样品的预处理 用无菌滤膜过滤后，根据试剂盒说明对样品滤液进行稀释，稀释倍数=标识质量浓度÷0.06×40（注：因处理过程中未对试样进行40倍稀释定容，需乘以40以纠正稀释倍数计算）。 　　95℃水浴加热组在过滤前于95℃水浴加热30 min，期间振荡混匀5次，水浴后迅速冷却至室温。 　　1.3.3 梯度标准溶液的配制 按试剂盒说明配制维生素B12标准品工作液，用无菌水对标准品原液进行梯度稀释，得到10%、20%、30%、40%、60%五个梯度的标准溶液，对应的维生素B12质量浓度分别为0.3、0.6、0.9、1.2、1.8 μg/L。 　　1.3.4 测定步骤 测定在超净工作台的无菌环境中进行。将适量微孔板条固定在微孔板架上，在每个微孔中先加入测试用培养基150 μL，再加入标准品溶液或样品稀释液150 μL，空白对照、标准品溶液、样品稀释液各做3个平行；加样完毕后，用配套黏合箔充分密封微孔板条，置于36℃培养箱中孵育44～48 h。 　　孵育完毕后，压实黏合箔上下颠倒微孔板3 min混匀，轻轻撕开黏合箔，除去气泡，在630 nm下读取吸光值A630。 　　1.4 标准曲线绘制与含量计算 　　以维生素B12质量浓度为横坐标，吸光度值A630为纵坐标绘制标准