霍乱弧菌检测20140506.pptVIP

学习要点： 霍乱弧菌概述与分类 霍乱弧菌的标本采集 霍乱弧菌的分离培养 霍乱弧菌的鉴定 大便≈小便 二、标本的采集与送检 概述： 标本采集： ?病例：粪便、肛拭子、呕吐物 未使用抗生素之前 “健康”人：粪便、肛拭子 其他传播环节的标本：食物、水、环境类样品…… ?监测：水样，水产品等 标本运送： 一般要求在6小时内室温（20-25 ℃ ）条件下送达实验室检测， ? C-B运输培养基（pH8.4）; （或文腊二氏保存液） ? 碱性蛋白胨水（pH8.4-9.2） ： 培养基质量的保证：碱性胨水要澄清透明（表明未长细菌）、 8-10ml量要足。不符合规定，立即通知相关实验室或CDC更换。 便量合适：不要太少，不能太多（改变培养基的pH）。 送检及时：6h内送检。 1、粪便标本 （1）采样 逢疑必采 应在发病早期，服用抗菌药物之前完成，并尽快送到检验室。粪便标本采集方法如下：用棉拭子采取自然排出的新鲜大便，也可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内3cm-5cm处采取，水样便采取1ml-3ml，成型便采取指甲盖大小的粪便量。 病人的呕吐物，沾染粪便的衣服和用具，也可作为检材。 注意！ 因腹泻病因复杂，霍乱轻型病例的症状与体征很不明显，不易与其他病因引起的腹泻相区别。因此，霍乱流行季节，逢泻必采是必须遵守的原则 4号平板 霍乱弧菌的血清学鉴定要点 9cm平板，1划1，严禁1划2。 纯培养做血清学鉴定。 凝集，肉眼可见大颗粒。不要误判。 血清学凝集同时做盐水凝集对照，自凝菌排除。 血清学凝集覆盖O1与O139。 霍乱弧菌鉴定，以血清学为主，血清学凝集阳性即可初步报告。区别于肠杆菌科细菌（生化报告）。 进一步实验 氧化酶试验 1％盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液 粘丝试验 0.5％去氧胆酸钠水溶液 进一步实验 生化鉴定 ?生化鉴定管： 发酵葡萄糖、甘露醇、 蔗糖、产酸不产气 能分解色氨酸 赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶（+） 精氨酸双水解酶（-） 霍乱弧菌生化鉴定管（11种生化,套装，环凯）； ?生化鉴定条：梅里埃API 20E鉴定条等 ?全自动生化检测仪检测：梅里埃VITEK2 COMP 全自动生化鉴定卡等 进一步分型鉴定(省CDC进行) ?噬菌体分型 ?PFGE脉冲场分型 快速检测试剂盒 1荧光PCR O1群、 O139群双色荧光检测试剂盒 霍乱CTX毒力基因荧光检测试剂盒 2胶体金技术 荧光PCR检测霍乱弧菌---初筛 ?挑取粪便，直接接种于碱性蛋白胨水（第一管）中，同时划线分离选择性平板（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板，第一板）。 ?第一管碱性蛋白胨水在３７ ℃增菌６－８小时，沾取菌膜下表层液体，划线分离选择性平板（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板，第二板），同时吸取0.1～0.2 ml表层培养物，接种碱性蛋白胨水（第二管）。 ?第二管碱性蛋白胨水增菌１８小时后划线分离选择性平板（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板，第三板）。 分离培养要点（两管三板法）： ? 经典的鉴定步骤要求每个平板应挑取5个以上可疑菌落,转种于克氏双糖斜面或者普通琼脂斜面待分纯培养后,再进行O1、O139群血清玻片凝集试验，鉴于对霍乱疫情应急处理的考虑,现大多数监测实验室一般采用将血清玻片凝集试验前置的做法,作为快速筛查的手段,直接对平板上生长的单个可疑菌落进行玻片凝集试验,出现明显凝集时可做初步报告,对平板上出现可疑凝集的菌株必须马上转种于克氏双糖斜面或者普通琼脂斜面,待纯培养物生长良好后再次进行玻片凝集试验加以确证。 ?庆大霉素平板和4号琼脂：多呈半透明状，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并随培养时间的延长而加深（由于这类培养基均含有亚碲酸盐成份）。 ?TCBS（硫代硫酸盐枸櫞酸盐胆盐琼脂）：菌落生长呈黄色发亮、表面光滑、润湿、稍凸起、边缘整齐。 （TCBS平板生长的菌落不能直挑取进行玻片凝集试验，需按经典方法进行纯培养后再进行玻片凝集试验） 可疑菌落的挑取 染色镜检 革兰染色阴性的短杆菌 血清凝集试验： 　 ?分别使用O1群，O139群霍乱血清进行凝集试验，同时使用生理盐水进行对照凝集，以排除与生理盐水发生凝集的自凝菌。 ?生理盐水不凝集，O1群血清明显凝集的菌落，进一步使用稻叶型和小川型血清进行凝集试验，判定型别：稻叶型血清凝集而小川型血清不凝集的菌落为稻叶型，小川型血清凝集而稻叶型血清不凝集的菌落为小川型，如稻叶型血清和小川型血清均出现凝集的时候，要注意鉴别是否为彦岛型，需进行试管凝集试验且两者的凝集效价均超过一半以上才能判定