分子生物学 DNA的复制、损伤与修复.pptx

Replication and damage repair 第二章 DNA的复制、损伤和修复 第一节 DNA的复制(Replication, DNA biosynthesis) 指DNA双链在细胞分裂以前进行的复制过程。 哺乳动物的细胞周期 （一）半保留复制 DNA在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制(semi-conservative replication)。 意义：半保留复制说明DNA在代谢上的稳定性。经过许多代的复制，DNA链仍可保持完整，这在生物的遗传上是十分重要的。 一、DNA 复制特征 DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M. Meselson 和 F. Stahl 所完成的实验所证明。该实验首先将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为15N。将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNA，作CsCl密度梯度离心. 半保留复制证据 （以原核生物 大肠杆菌为例） 原料： dNTP，Mg++ 双链DNA模板 引物（primer），常是RNA，有游离的 3’OH。 引物酶（primase，DnaG），用于合成复制所必需的RNA引物 解螺旋酶 ( helicase ) , DnaB, 由DnaA和DnaC协助在复制的起始点（Ori C）上解开双螺旋。 与复制有关的酶和因子 复制的起始点与方向 亲代DNA开链，复制起始点呈叉型移动 复制起始点（ori）：DNA复制要从DNA分子的特定部位开始，此部位称复制起始点 ????原核：一个起始点，约245bp,特殊的重复序列 ????真核：多个起始点 ori E.coli复制起始点oriC跨度为245bp，包括两个关键序列：13bp的序列和9bp序列,它是决定和控制E.coli染色体复制的唯一片段。 13bp序列区，每一个顺序都由GATC开始，富含A和T，有助于螺旋解开，控制复制何时开始。 9bp重复序列，重复出现4次，能与起始蛋白dnaA特异结合，当dnaA蛋白（约20种）结合于ori的4个部位上时复制开始。  dnaA蛋白（一种专一的蛋白）和ori结合后，双螺旋解开形成复制叉。故dnaA蛋白与启动解链有关,dnaA蛋白是起始的关键成分。 大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列 复制方向 DNA合成的方向单向、双向？ 1个起始点 复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图(Caims实验) 将3H-胸苷标记大肠杆菌DNA，经过近两代的时间，3H-胸苷掺入大肠杆菌DNA 。用溶菌酶把细胞壁消化掉，使完整的大肠杆菌染色体DNA释放出来，放射自显影，得到上图。非复制部分（C）银粒子密度较低，由一股放射性链和一股非放射性链构成。已复制部分站整个染色体的三分之二，其中一条双链（ B ）仅有一股链是标记的，另外一股双链（ A ）的两股链都是标记的，银粒子密度为前二者的两倍。染色体全长约为1100微米。 双向复制 复制子 真核生物两个相邻复制起始点之间的DNA片段 以起始点为中心，向两个方向进行复制 多个起始点 二、 DNA复制的酶学 1. 模板：解开成单链的DNA母链 3. DNA聚合酶，DNA-pol 2. 底物dNTP ：dATP，dGTP，dCTP，dTTP 4. 引物（primer）：RNA引物 5. 其他酶和蛋白质因子 一、复制的化学反应 生成磷酸二酯键 +dN2TP +PPi DNA pol 3’——TAGAAGACCTATTGGCC——5’ 5’——ATCTTCTGGATAACCGG——3’ 二、 解链相关酶类 1. 解旋酶(helicase) 2. 拓扑异构酶（topoisomerase I、II） 3. 单链DNA结合蛋白(SSB) DNA解旋酶(helicase)（解链酶） 功能：DNA的双螺旋解链（解DNA双链），解开一对碱基，需2分子ATP， 作用点：DNA上局部单链处，向双链方向解链。 种类：E.coli有四种解螺旋酶，I、II、III和rep蛋白。 I、II、III中任一种沿模板5-3 方向移动，rep蛋白沿模板3 -5方向移动。 2. 拓扑异构酶（Topo） DNA正超螺旋与负超螺旋 负超螺旋 正超螺旋 DNA双螺旋 拓扑异构酶 首先在大肠杆菌中被发现，它可使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无需供给能量。 另外，DNA复制时负超螺旋的消除，亦由拓扑异构酶Ⅰ来完成，但它对正超螺旋无作用。 Ⅰ型拓扑异构酶 由两个A亚基和两个B亚基组成，即A2B2。它能使D