核酸测定.pptVIP

一、紫外分光光度法 二、ECL法 三、共振光散射法 四、荧光探针菲啶溴红法 五：地衣酚法测定RNA含量 一、紫外分光光法（定磷法） 原理：①元素分析表明，RNA含磷量平均为9.4%，DNA含磷量平均为9.9％，由此可以推导出核酸质量约为其含磷量的11倍，因此可从测得的核酸样品的含磷量计算核酸的含量。②DNA、RNA分子在强酸作用下降解的糖，再与浓酸、酚或胺生成的有色化合物，其颜色深浅与核酸含量呈正比，因此通过比色法可测得核酸的含量。 二、ECL法 ECL(电化学发光分析):将电化学和化学发光完美结合的新型免疫分析技术电化学发光技术(electroehemiluminesenee,ECL),同时联合新型的免疫固相放大技术—链霉亲和素系统,在免疫学检浏中尤其是核酸测定中,发挥了以往的发光技术无可比拟的优势。 三、共振光散射法 原理：在普通荧光分光光度计上进行测量的分析技术，灵敏度高、简便快速。该技术可以用于研究核酸与有机小分子探针间的相互作用并进行核酸的定量测定。在核酸测定分析中，该方法的灵敏度主要取决于探针分子与核酸作用的强弱，因此寻找灵敏的核酸测定的探针成为核酸分析的重要内容 四、荧光探针菲啶溴红法 原理：常温下核酸自身荧光很弱,不能直接探测到。利用荧光探针—菲啶溴红( 简称Eth Br )插入核酸的双链区时,其量子产率大大增高,它和核酸形成一种较强的荧光络合物。在一定条件下,这种络合物的荧光强度和核酸的浓度成正比利用核酸酶处理就能确定样品中DNA和RNA的含量利用这种方法可检测核酸的最小含量为0.02微克/ 毫升 原理：核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糖醛，后者与3，5—二羟基甲苯（地衣酚）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂，反应产物在670nm处有最大吸收，RNA浓度在20200微克/毫升范围内，光密度与RNA的浓度成正比关系，在反应液中如混有DNA或其他杂质。也能给出类似的颜色。因此测定RNA时可先测定DNA的含量，再计算RNA的含量。 五、地衣酚法测定RNA含量