透析袋.docVIP

PAGE  PAGE 55 生 物 化 学 实 验 指 导 第一部分 常用生物化学实验技术及原理 第一章 透 析(Dialysis) 透析是利用小分子能通过,而大分子不能通过半透膜的原理把它们分开的一种重要手段。通常的做法是将小分子和大分子的混合物放进用半透膜制成的透析袋里并沉没在大量的水中。袋内的小分子就不断通过膜进入外部溶剂中待达到平衡为止。如果对流水透析或不断更换透析袋的溶剂可以做到袋内的混合物几乎不含小分子。透析的速度受一些因素的影响。下面就粗略地讨论这些因素。 一、膜 1、材料 火棉胶是最常用的透析袋材料。各种规格的火棉胶袋已做成商品出售。也可用玻璃纸代替火棉胶。 2、制备 先将一适当大小和长度的透析管放在碱性EDTA溶液中沸腾30分钟以避免待透析的分子损失活性。然后，用蒸馏水洗涤透析管。结扎管的一端并将所研究的材料充满透析管（袋），然后结扎顶部。透析最好在新制备的管中进行，因为湿的透析袋非常容易受微生物感染。如果必须保存透析袋，则应有溶液中加入痕量的苯甲酸。 3、通透性 透析袋的通透性因袋的大小和预处理的方法不同而异。但透析过夜时，半透膜大体可以允许相对分子质量（Mr）30000以下的化合物通过。实际上没有严格的界限，透析时间延长时稍大的分子也透过膜。有一系列的商品材料有更高的透析速度和更精细的通透范围可做精细分离之用。 二、溶剂 1、水溶液 一般说，透析的速度在蒸馏水中最大，虽然通常需要特定的pH和离子强度的水溶液来稳定所研究的分子。 2、大分子溶液 透析时水将进入透析袋，因此应该将透析袋装满以避免透析的材料过于稀释。如果用一种不活泼的高分子化合物如聚乙烯醇6000代替通常使用的水溶液作为溶剂，则透析时水就会由透析袋中渗出，用这种方法透析过夜，可将200mL溶液浓缩至几mL。 三、物理条件 1、温度 透析速度也受温度的影响，温度越高透析速度越快。提高温度时，溶剂的粘度降低而扩散速度增加。此外，许多大分子对温度很敏感，因此蛋白质等的透析通常在低温条件下进行。 2、压力 大分子和小分子的分离也受通过膜时的压力梯度影响。可将透析袋放在真空中（而不放在溶液中），并敞开透析袋的一端，此时水和小分子会渗出透析袋形成超滤液，而留在透析袋中的大分子被浓缩。这个过程称为超滤。 四、董南(Donnan)膜平衡 由于大分子电解质的存在，而使一般电解质不均等分配在半透膜两侧的平均状态，称为膜的平衡。 蛋白质溶液的渗透压与溶液的pH有关系。有酸性pH下，蛋白质以阳离子存在，带有正电荷；而在碱性pH下，以阴离子存在，带有负电荷。当蛋白质盐溶液透析时，带电的蛋白质分子不能透过半透膜，而溶液中对立的阴离子或阳离子就要通过半透膜以平衡电荷，这就导致离子的膜两边不均等的分布，同时关系到pH的变化。这种现象有就称为董南效应，又称分布，同时产生pH的变化。这种现象就称为董南效应，又称董南平衡。如带负电荷的蛋白质盐溶液对水透析时，蛋白质不能透过透析袋，而它的反离子可以通过，结果造成环境介质中阳离子过多。为了保持中性，水就分解出氢离子移进透析袋内，蛋白质部分的pH因此下降而水部分的pH上升。反之，如蛋白质带正电荷，则pH的变化相反。董南效应可以导致蛋白质沉淀或变性，因而是不可取的。为减少董南效应，透析通常对具有适当浓度的盐溶液进行。 第二章 层析法(Chromatography) 层析法也称色谱法，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的（称为固定相），另一个相则流过此固定相（称为流动相）并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。 层析法是近代生物化学最常用的分析方法之一，运用这种方法可以分离性质极为相似，而用一般化学方法难以分离的各种化合物，如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。 层析法有许多种类，可以根据所用两个相的状态和操作方式不同进行分类如表2-1。 表2-1层析法的一般分类 固定相流动相操作方式名称固体：吸咐剂 离子交换剂 固体 液体 液体 液体 固体 液体液体 液体 液体 液体 液体 气体 气体柱型 薄层 柱层 薄层 纸 柱型 柱型吸附层析 离子交换层析 吸附薄层层析 分配层析 分配薄层层析 纸层析 气体吸咐层析 气体分配层析此外，还有凝胶层析、亲和层析和高压液相层析等方法。在讨论几种常用的层析法之前，先介绍一下柱层析法的一般技术。 一、柱层析法的一般技术 1、柱 层析柱通常是玻璃的。总的说来，长柱分辨力好，但大量物质的处理则用粗的柱比较适宜。 2、层析材料的准备许多材料都可在层析法中使用。在装柱前这些材料要用溶剂平衡，另外还需作一些预处理。例如，凝胶层析材料需要溶胀，吸附剂需要加热或酸处理来活化，离子交换树脂需