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限制性作图 定义：将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置。 局限性：只能应用于相对较小的DNA分子。 §3 Physical mapping §3.2 限制酶作图 荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH） * * * * 遗传图与物理图的整合 有些标记既是遗传标记，又是物理标记，如RFLP标记、SSR标记和某些基因序列 借助这些标记可以将遗传图和物理图整合起来 基因组测序策略 有了高密度的基因组图谱，就可以开始全基因组测序了 测序的技术飞速发展，现在可以全自动化 测序的策略有两个： 鸟枪法 克隆重叠群法 采集5个自愿者的DNA样品 构建3种不同插入子大小的基因组文库2Kb, 10Kb和50Kb 完成约2700万次插入子末端测序,总长14800Mb GeneBank下载104018个BAC末端顺序 PFP发表的公开数据主要为BAC克隆的顺序,共4443.3Mb 随机测序与序列组装方法和 指导测序与序列组装方法 相结合进行序列组装 国际人类基因组测序策略 构建BAC克隆 ↓ 限制性酶处理获得指纹 ↓ 根据指纹重叠方法组建BAC克隆重叠群 ↓ 根据STS标记,将BAC克隆重叠群标定在物理图上 ↓ 每个BAC克隆内部采用鸟枪法测序,组装 ↓ 将BAC插入顺序与BAC克隆指纹极重叠群对比,将已阅读的顺序锚定到物理图上 克隆重叠群法（clone contig） 将基因组DNA切割长度为0.1Mb－1Mb的大片段，克隆到YAC或BAC载体上 然后再进行亚克隆，分别测定单个亚克隆的序列 再装配、连接成连续的DNA分子。 这是一种自上而下的测序策略 clone-by-clone method (3)序列图谱（分子水平的物理图谱） 以某一染色体上所含的全部碱基顺序绘制的图谱。 既包括可转录序列，也包括非转录序列，是转录序列、调节序列和功能未知序列的总和。 测定序列 （3）基因组测序与序列组装 基因组计划的最终目标是获得所研究的生物的完整的DNA顺序。最佳状况是将物理图谱和遗传图谱进行有机整合，以便于确定基因以及其他重要的序列在DNA顺序中的位置。这里主要介绍基因组测序中所采用的技术和策略。 主要内容： 1.DNA测序的方法 2.DNA顺序的组装 * DNA测序的方法 DNA测序技术主要有两种方法，都是在20世纪70年代中期发明的。 A.链终止法（the chain termination method），是通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链来读取待测DNA分子的顺序。 B.化学降解法（chemical degradation method），是将双链DNA分子用化学试剂处理，产生切口，用同位素标记进行测序。 * DNA顺序的组装 主要有两种方法将大量短的DNA顺序组装起来，鸟枪法及克隆重叠群法。 鸟枪法和重叠群法 基因组计划的基本目标是获得全基因组顺序，在此基础上再对所获得的序列进行解读。获得基因组顺序的主要方法是进行DNA测序，然后再将读取的顺序组装。目前的DNA测序每次反应仅能读取不到1000bp的长度，已知最小的细菌基因组为580kb。因此基因组测序的第一步是构建基因组图，然后将基因组区段分解逐个测序，最后进行组装。基因组作图的基本构想是，在长链DNA分子的不同位置寻找特征性的分子标记，根据分子标记将包括这些序列的克隆进行连锁定位，绘制基因组图。一旦构建好基因组图，即可着手进入全基因组测序。以基因组图指导的测序有2种路线： 重叠群法 和 直接鸟枪法 * 什么是鸟枪法 全基因组随机测序战略主要采用鸟枪法（shotgun）。鸟枪法，也俗称“霰弹法”，是随机先将整个基因组打碎成小片段进行测序，最终利用计算机根据序列之间的重叠关系进行排序和组装，并确定它们在基因组中的正确位置。  鸟枪法 “鸟枪法”优点：速度快，简单易行，成本较低，可以在较短的时间内通过集中机器和人力的方法获得大量的基因片断。 “鸟枪法”缺点：最终排序结果的拼接组装比较困难，尤其在部分重复序列较高的地方难度较大。此外有许多序列片段难以定位在确切的染色体上，成为游离片断；同时又会有许多地方由于没有足够的覆盖率而形成空缺。这些缺陷最终导致整个基因图会留下大量的空洞（gap），也影响其准确度。 * 重叠群法 以大片断定位的克隆为基础的定向测序战略主要采用克隆步移法或称重叠群法。 过程：先构建遗传图，再利用几套高度覆盖的大片段基因组文库（BAC、PAC等）获得精细的物理图，选择合适的BAC或PAC克隆测序，利用计算机拼装。BAC内的空洞基本上都可以利用设计引物等手段填补，形成一条完整的BAC序列。然后由相互关