武汉大学医学部膜片钳安装培训V剖析.pptVIP

膜片钳电学基础 测量的位置：胞内/膜上/胞外 Recording Principle Intracellular (transmembrane potential) Extracellular (Action potentials) Patch-clamp Micro Electrode Array (MEA) (extracellular fieldpotential) 一个典型的实验过程 细胞等效电路 基本电学—欧姆定律电容充放电 膜片钳放大器的补偿原理 膜片钳基本电路原理 膜片钳基本电路原理-电压钳 电压钳/电流钳类比 电压钳-Voltage Clamp 钳制电压，测量电流。 电流钳-Current Clamp 钳制电流，测量电压。 电压钳-电容的充放电波形 全细胞模式下等效电路 全细胞电压钳的各个电流波形 补偿原理：提供另一支路 快电容(电极电容)补偿 慢电容(膜电容)补偿 电流波形补偿全图（200B） 电流波形补偿全图（700B） 串联电阻?? 串联电阻引起的钳位误差 串联电阻补偿(200B) 串联电阻补偿(700B) 谢谢大家！ 电压钳(Voltage Clamp) 当细胞膜上的离子通道开放，产生跨膜电流；但是跨膜电流会引起膜电位的改变。膜电位的改变一方面会影响离子通道的开放数量；同时也会影响离子流过通道的驱动力。这两个因素反过来又对跨膜电流产生影响。此时记录到的电流受多方面因素的影响，很难进行分析。 电压钳是保持细胞膜电位不变，同时记录离子跨膜电流的一种方法。跨膜电流是由Na+, K+, Ca2+, Cl-离子通过细胞膜上的离子通道所产生的。 Im Vm Vc ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － － － － － － － Na＋ Na＋ 双电极电压钳原理图 e Cl－ Ag/AgCl Vm＝Vc e Vm＝Vc 脑片膜片钳技术 1．脑片撕裂法（Slice rending method） （引自： Stuart et al., 1993） （引自：Ascher P, 1989） 10μM 10μM a b （引自：The Axon Guide》，1993。有改动） 2．表面清洁法 （Surface cleaning 法） 3. 红外微分干涉相差显微镜法（IR-DIC法 ） 4.盲法 （Blind 法） 海马脑片CA1区锥体神经元的IR-DIC影象 海马脑片CA1区中间神经元的IR-DIC影象 举例一 离子通道研究 ---------Voltage-depended Ca2+ ion channel 三、常见离子通道电流的记录： 1. Na+通道电流：全细胞记录 离子通道动力学性质的研究 （以海马脑片全细胞记录模式为例） I A currents 2 nA 20ms Na + currents I K currents Vh=- 80mV 40mV - 60mV 电压门控性全细胞电流 2nA 10ms -50mV Conditioning pulses Testing pulses Vh =-90mV 钠通道的失活 2nA 20ms -50mV Vh= -90mV 钠通道失活后的恢复 电压门控性IK电流 5ms 2nA 50ms 1nA Vh= -70mV 70mV -50mV 70mV 60mV 50mV 电压门控性钙电流 细胞的胞吐与胞吞功能测定 通过膜电容测定法可观测细胞内分泌颗粒膜与胞质膜融合过程。膜电容在细胞膜不发生折叠时，与细胞膜表面积成正比，因而可通过膜电容的变化反映胞吐与胞吞过程及其机制。另外，膜融合产生的一过性电流也可记录到。 几乎所有细胞的脂质双层膜其电容均为1μF/cm2 与Ca2+通道邻近的递质囊泡可被单一动作电位激活而释放递质； 而远隔部位的囊泡则需要一串动作电位的发放。说明若要大量的递质释放必须有大量的Ca2+进入。 Ca2+通道 递质囊泡 光解释放技术 膜电容测量和微碳纤电化学测量 膜电容测量法和微碳纤电化学测量：时间分辨率高（ms级）。 细胞分泌研究----电位依赖性分泌 细胞分泌----离子依赖性研究 --------with FLASH technology 细胞内钙测定与膜片钳的结合 细胞内钙测定与膜片钳的结合 采用钙荧光测定技术和膜片钳技术同时进行的手段，可实时地监测单一细胞内游离钙浓度的变化与通道电现象变化的对应关系。 荧光测钙技术-PhotoMetry系统 荧光测钙技术-PhotoImage系统 今天的膜片钳电生理学 现在 过去 平面膜片钳 Precision Range Control Hole Geometry consis