用弗氏柠檬酸菌酶法合成L酪氨酸教案.pptVIP

项目四 用弗氏柠檬酸菌酶法合成L-酪氨酸 ——汇报方案 姓名：张婉月 班级：生药1311 学号：2013040829 组别：第2组 指导老师：彭加平 韦平和 目录： 基础知识 弗氏柠檬酸菌的培养及破碎 酪氨酸酚裂解酶的活力测定 用弗氏柠檬酸菌酶法合成L-酪氨酸 酶法合成产物L-酪氨酸的分析鉴定 基础知识： 弗氏柠檬酸菌 直径约1.0，长2.0~6.0μm，单个和成对。 弗氏柠檬酸杆菌隶属肠杆菌科(Enterobacteriaceae)枸橼酸杆菌属(Citrobacter)。该菌革兰氏阴性，需氧或兼性厌氧，为条件致病菌，广泛分布于自然界中，是人和动物(哺乳类、鸟类、爬行类及两栖类)肠道内正常的菌群。 药物敏感性试验结果表明，该菌对氟罗沙星、头孢曲松、环丙沙星、恩诺沙星、依诺沙星、氧氟沙星、左氟沙星等7种抗生素高度敏感。 L-酪氨酸 中文名称:L-酪氨酸 中文别名:L-β-对羟苯基-β-丙氨酸;(2S,3R)-2-氨基-3-对羟苯基丙酸 英文名称:L-Tyrosine L-酪氨酸属氨基酸的一种，白色结晶体或结晶粉末，无味，易溶于甲酸，难溶于水，不溶于乙醇和乙醚。在稀盐酸或稀硝酸中溶解。 一种含有酚羟基的芳香族极性α氨基酸。是组成蛋白质的20种氨基酸中的一种，是哺乳动物的必需氨基酸，又是生酮和生糖氨基酸。 【性状：】 L-体从水中结晶出来者，无色至白色丝光针状结晶或结晶性粉末；d-体从水中结晶者为无色晶体；dl-体从水中结晶者为有光泽的针状晶体。纯品稳定，烃类共存下则易分解。化学性较活泼。微溶于水（0.04g/100ml,25度）。溶于稀无机酸和碱性溶液。不溶于无水乙醇和乙醚。属非必需氨基酸。 超声波 超声波是物质介质中的一种弹性机械波，它是一种波动形式，因此它可以用于探测人体的生理及病理信息，既诊断超声。同时，它又是一种能量形式，当达到一定剂量的超声在生物体内传播时，通过它们之间的相互作用,能引起生物体的功能和结构发生变化，即超声生物效应。超声对细胞的作用主要有热效应，空化效应和机械效应。热效应是当超声在介质中传播时，摩擦力阻碍了由超声引起的分子震动，使部分能量转化为局部高热（42-43℃），因为正常组织的临界致死温度为45.7℃，而肿瘤组织比正常组织敏感性高，故在此温度下肿瘤细胞的代谢发生障碍，DNA、RNA、蛋白质合成受到影响，从而杀伤癌细胞而正常组织不受影响。空化效应是在超声照射下，生物体内形成空泡，随着空泡震动和其猛烈的聚爆而产生出机械剪切压力和动荡，使肿瘤出血、组织瓦解以致坏死。 弗氏柠檬酸菌的培养及破碎 革兰氏阴性，通常以周生鞭毛运动。兼性厌氧。有呼吸和发酵两种类型的代谢。 在普通肉胨琼脂上的菌落一般直径2～4mm，光滑、低凸、湿润、半透明或不透明，灰色，表面有光泽，边缘整齐。偶尔可见粘液或粗糙型。 氧化酶阴性。接触酶阳性。化能有机营养，能利用柠檬酸盐作为惟一碳源。硝酸盐还原到亚硝酸盐。没有赖氨酸脱羧酶。不产生苯丙氨酸脱氨酶、明胶酶、脂肪酶和DNA酶。不分解藻朊酸盐和果胶酸盐。发酵葡萄糖产酸产气。甲基红试验阳性。VP试验阳性。 实验材料 （1）菌株 弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii） （2）试剂 LB培养基 配方：酵母提取物 5g 蛋白胨10g NaCl 5g 琼脂 15～20g 水 1000mL pH 7.4～7.6 实训步骤 （1）菌种培养 配制培养基 菌种活化 待灭菌后的固体培养基冷却至50℃时，倒入平板中，待平板凝固后，挑取菌种进行划线接种。接种好的平板倒置放于培养箱，37℃培养24h。 ③扩大培养 挑取上面培养好的菌落，放入已灭菌好的液体培养基的三角瓶中进行扩大培养。37℃、200r/min摇床过夜培养。（培养时间不能太长，否则细菌老化，代谢产物太多） （2）破碎细胞 ①菌体收集 取已经培养过夜的弗氏柠檬酸菌菌悬液于离心管中，3000r/min 离心5min，弃上清液，收集菌体。 酪氨酸酚裂解酶的活力测定 福林酚试剂是磷铂酸盐与磷钨酸盐的混合物。它在碱性条件下不稳定，能被酪氨酸中的酚基还原，生成铂蓝、钨蓝的混合物。酪蛋白在蛋白酶作用后产生的酪氨酸可与福林酚试剂反应，所生成的蓝色化合物可用比色法测定。 用弗氏柠檬酸菌酶法合成L-酪氨酸 酪氨酸酚裂解酶( tyrosine phenol-lyase，TPL，EC4.1．99．2) ，也称 β-酪氨酸酶，在生物体内催化L-酪氨酸裂解生成苯酚、丙酮酸和氨，但在生物体外可将苯酚、丙酮酸和氨转化为L-酪氨酸而L-酪氨酸常作为营养增补剂、苯丙酮尿症患者的必需氨基酸，以及L-多巴、黑色素、对羟基肉桂酸、对羟基苯乙烯等医药化工产品的制备原料。 TPL催化L-酪氨酸裂解的最适pH为8．