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II. ヒストン修飾解析 ヒストン修飾の解析には、クロマチン免疫沈降（ChIP）法が用いられます。解析目的の修飾ヒストン抗 体でChIP を行い、濃縮物をリアルタイムPCR やマイクロアレイで解析します。 A. クロマチン免疫沈降（ChIP） ◆ヒストン修飾の解析に ◆ChIP には高品質の修飾ヒストン抗体を 【1】原理 試料からクロマチンを調製し、超音波またはMicrococcal Nuclease で断片化後、各種抗体を用いて免疫 沈降を行います。濃縮した産物は、リアルタイムPCR やマイクロアレイにより解析します。 ・各種修飾ヒストン抗体 現在、クロマチン免疫沈降(ChIP: chromatin immunoprecipitation)法を用いた、修飾ヒストンのゲノム 上局在解析は、エピジェネティクス研究をすすめる上で必要不可欠な解析手法となっています。ただし、 これまで広く利用されてきたポリクローナル抗体を用いたクロマチン免疫沈降では、市販ポリクローナ ル抗体のロット差に起因し、再現性の良い結果が得られにくいなどの問題点が指摘されてきました。こ うした理由から、修飾ヒストンのChIP 解析には、特異性の高い高品質なモノクローナル抗体の利用が極 めて重要です。タカラバイオでは、ChIP 解析に利用可能な*株式会社モノクローナル抗体研究所製の高 品質な抗修飾ヒストンモノクローナル抗体を各種取り扱っています。これら高い特異性を持つモノクロ ーナル抗体を、ChIP 解析など修飾ヒストンの解析に是非ご利用ください。 * Cell Struct Funct. 2008; 33 (1): 61-73. エピジェネティクス実験のススメ ヒストン修飾解析 1/6 1107 ・EpiScope® ChIP Kit (anti-mouse IgG) 本製品を用いると、細胞のクロスリンクからDNA 溶出までを最短１日で行うことができ、磁気ビーズを 使用するため操作が簡単でバックグラウンドも低く抑えられます。また、回収されたDNA は精製操作を 行わずにリアルタイムPCR 解析に使用可能で、DNA 精製を行う場合は高速シーケンスやマイクロアレ イ等の解析にも使用できます。 【2】プロトコール ここでは、EpiScope® ChIP Kit /anti-mouse IgG を用いた実験の流れをご紹介します。操作方法の詳細 は、製品説明書をご参照ください。 1 クロマチンの調製 6 1.1 ～5 ×10 個の細胞を終濃度1%のホルムアルデヒドでクロスリンクする。 1.2 Quenching Solution を添加し、クロスリンク反応を止める。 1.3 遠心して細胞を回収しCytoplasmic Lysis Buffer により細胞を溶解する。 1.4 遠心して細胞を回収しSDS Lysis Buffer により核を溶解する。 1.5 超音波破砕により、クロマチンを200～800 bp 程度に断片化する。 1.6 遠心して不溶性残渣を除き、Dilution Buffer で希釈し、分注する。 （1/10 量をInput 画分として4℃保存する。） 2 免疫沈降 2.1 クロマチン溶液に抗体と洗浄済みの磁気ビーズ（Magnosphere™ anti-mouse IgG）を添加し、 4℃で4 時間以上、ローテーターで撹拌する。 2.2 ビーズを洗浄する。 3 DNA の抽出と精製（Input 画分も同様に処理する） 3.1 95℃で15 分間インキュベートし脱クロスリンクする。 3.2 Proteinase K 処理とRNase A 処理を行う。 3.3 後の解析に適した方法でDNA の回収および精製を行う。 4 リアルタイムPCR Input 画分をコントロールとして、リアルタイムPCR によりターゲット領域の定量を行う（「i リアルタ イムPCR」の項を参照）。 【3】実験例 6.0 ×106 個の HeLa 細胞からクロマチンを調製し、修飾ヒストン抗体 Anti-monomethyl Histone H3(Lys4), mouse monoclona