动物细胞培养课件资料讲解.pptVIP

细胞克隆技术 培育细胞系可采用细胞克隆技术。 一个克隆的细胞群体是从一个单一母细胞繁殖而来，分离单一细胞并使其繁殖为一细胞群体的方法称为克隆化(cloning)。 细胞克隆技术的方法 1.稀释铺板法 2.饲养层克隆法 3.胶原膜板或纤维蛋白膜板克隆法 4.琼脂克隆法 5.在琼脂基底上用甲基纤维素克隆法 细胞系鉴定 当细胞系建立后，应对细胞系进行一系列鉴定后，才能应用于细胞生物学、免疫学、细胞遗传学等方面的研究。鉴定内容应包括: 1)细胞系的细胞来源； 2)鉴定细胞系的纯度，即除了主类细胞外，还杂有哪类细胞； 3)细胞系的稳定性，即在细胞连续培养过程中主要指标应无明显变化； 4)累积细胞系的形态及其表达特征的基本数据，以及其与来源细胞的差异等； 细胞系鉴定指标 1.形态学：活细胞观察；固定染色观察培养细胞。 2.染色体： 染色体是一种鉴定细胞系的种属、性别来源较为确切的指标；也是检查细胞系是否趋于稳定，在离体培养条件下细胞有否发生转化的可靠指标；是区别正常细胞与恶性细胞的指标。 采用染色体数目、核型分析以及染色体分带技术检测。 3.同工酶谱： 通常采用G6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、LDH(乳酸脱氢酶)、核苷磷酸化酶三种方法，根据条件选择。 细胞系鉴定指标 4.细胞DNA遗传特征: 限制性片断长度多态性(restriction fragment length polymorphism RFLP) 是指那些在生物进化过程中，DNA序列发生某些中性突变，突变的结果是失去或获得一个酶切点，因此当基因组DNA用限制性内切酶酶切后，限制性内切酶片断加长或缩短；用同源的克隆DNA为探针可以探测出来。另外也可能在生物进化过程中DNA分子结构发生重排，使DNA碱基排列序列改变，影响内切酶切点,使内切酶酶切片断呈多态性。 一般采用Southern印迹杂交法检测。 细胞系鉴定指标 培养细胞的污染问题及检测 细胞培养的污染问题十分重要，一旦发生污染，将导致前功尽弃。所以细胞培养一定要建立无菌观念。遇到培养污染要分析原因，及时处理。 细胞污染的种类和判定 细胞培养中常见的污染物有细菌、酵母菌、真菌、支原体和病毒等。在出现以下情况时培养的细胞可能有污染： 1) 培养液的酸碱度发生异常的改变。 2)培养液出现混浊。 3)光镜观察到菌丝和颗粒。 4)细胞出现死亡或增殖缓慢等。 污染物的检测 1.细菌和真菌污染的检测： 1）涂片染色镜检； 2）接种培养：Trypticase大豆肉汤、BHI、Thioglycocollate肉汤和血琼脂板适于广泛的细菌检测；Sabouraud肉汤、YM肉汤和营养肉汤适于检测真菌。 检测到阳性结果后，应高压灭菌处理污染的培养物及其用具。 2.支原体检测: 支原体污染细胞后，能抑制细胞代谢和生长，改变核酸合成，影响细胞的抗原性，引起细胞染色体改变，干扰病毒的复制，以及具有类病毒作用。在培养细胞初期，由于支原体对细胞的繁殖影响较小而往往被忽略。 污染物的检测 支原体检测方法和处理 1）荧光技术检测：支原体含有DNA，能与一种荧光染料Hoechest 33258特异性的结合，可根据细胞表面的荧光来显示细胞是否污染有支原体。 2）直接培养法：实验室常用。 3）放射自显影检测： 4）DNA分子杂交： 检测完毕后，所有实验用具均应经过高压消毒处理。 5）污染支原体后的处理： 抗生素处理：如加入泰乐菌素等。 共培养法：与巨噬细胞共培养。 重新克隆法：抗生素处理后，将细胞稀释后传代，每周换2次含抗生素的新鲜培养液，4~5周后，重复克隆2次。 过滤法：0.22μm孔径滤膜正压过滤。 支原体检测方法和处理 污染病毒的检测 1）致细胞病变效应（CPE）或集落的检测：采用相差显微镜检测 2）血细胞吸附试验； 3）鸡胚接种。 细胞间交叉污染 为避免细胞间交叉污染，应注意： 了解各细胞系的特征； 培养各细胞系的操作手续要快速； 培养各细胞系不用同一瓶的培养液和酶等； 吸过培养液和细胞悬液的吸管，不能放回储存培养液和酶的瓶内； 经常检查培养物特征，注意任何突然的形态学改变，通过染色体或同工酶谱分析，检查是否有交叉污染。 在体外培养工作中，常要将体外培养物进行冷冻保存，在需要时再复温融解进行体外培养（复苏）。要获得好的冻存与复苏效果，必须了解如下几个问题：冷冻速率、复温速率、冷冻保护剂，冷冻保存温度。 细胞保存 1、 冷冻速率 冷冻速率是指降温的速度，是活细胞能否被冷冻到一个能永久保存的温度的一个主要因素。冷冻速率太快或太慢都会造成细胞的损伤，只有以最适的冷冻速率冷冻细胞，才能获得最佳的冷冻保存效果