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阿霉素引起大鼠胚胎H9c2心肌细胞肥大并不必需激活钙依赖磷酸酶：磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶Akt路径参与 摘要 钙/钙调素依赖磷酸酶已被发现是在体内外诱导心肌肥厚的必需物质。抗肿瘤药物阿霉素（DOX）可激活在H9c2心肌细胞的钙依赖磷酸酶信号。然而这种导致肥厚的机制并未被研究。因而本研究的目的在于探究阿霉素诱导心肌细胞肥大过程中钙依赖磷酸酶活化情况。在钙调磷酸酶抑制剂环孢素A（CsA或FK506存在情况下，用1μM阿霉素对H9c2心肌细胞预处理2小时。治疗8至48小时后，对钙调神经磷酸酶信号转导和细胞肥厚进行分析。阿霉素的处理活化钙依赖磷酸酶信号并导致细胞肥大的同时，细胞体积的和细胞蛋白含量有所增加。钙依赖磷酸酶的抑制剂CsA、FK506阻止阿霉素诱导的钙依赖磷酸酶信号。然而这并没有阻止抑制阿霉素诱导的H9c2心肌细胞肥大反应。进一步评估阿霉素诱导H9c2心肌细胞肥大可能的信号表明，阿霉素处理导致丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的磷酸化,这是磷酸肌醇3-激酶（PI3K）的下游反应。此外，阿霉素诱导肥大反应受到PI3K特异性抑制剂LY294002[?2 -（4-吗啉基）- 8-苯-4H-1-苯并吡喃-4-1?]的抑制。以上研究结果表明，虽然钙依赖磷酸酶受到阿霉素处理的活化，但对阿霉素诱导的心肌细胞肥大并不必需。相反，磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶Akt信号通路在阿霉素诱导心肌细胞肥大过程中起到更重要的地位。 心肌肥大是一种对大量内外刺激因素的主动适应，表现在心肌细胞的大小和蛋白质的合成，肌节组织的增加和心脏基因程序表达（Frey和Olson，2003）。长期肥大是众多心血管疾病的终点，并会导致心律失常、猝死和和心脏衰竭（Ho et al，1993；Lloyd-Jones 等人，2002）.调控心肌细胞肥大的分子机制吸引了众多关注，并且在这过程中存在众多信号转导通路（Frey和Olson，2003）。其中一个通路涉及钙/钙调素依赖的蛋白磷酸酶——钙依赖磷酸酶。 钙依赖磷酸酶是一种广泛表达丝氨酸和苏氨酸的磷酸酶，可被细胞内持续升高的活性钙激活。活化的钙依赖磷酸酶已被发现是在体内外诱导心肌肥厚的必需物质（Molkentin et al，1998）。活化的钙依赖磷酸酶可促使活化的T细胞（NFAT）核因子去磷酸化，这是钙依赖磷酸酶引起的基础性下游转录效应(Crabtree and Olson, 2002)。由钙依赖磷酸酶介导的NFAT去磷酸化引起NFAT核快速导入，诱导胎儿心脏基因表达并引发随后的肥大反应（Molkentin et al，1998；Crabtree and Olson, 2002）。钙依赖磷酸酶已被证明参与培养的新生代心肌细胞针对苯肾上腺素和血管紧张素II以及和最近已被证明可抗肿瘤药物阿霉素（DOX）等兴奋剂的肥大反应(Molkentin 等人, 1998; Kalivendi 等人,2005)。阿霉素是化学医疗试剂多组分中一个有价值的成分，然而，严重的心脏毒性是影响其临床应用主要限制因素（Ferrans，1978）。在体内，阿霉素治疗会导致心脏肥大（Sun 等人, 2001）。在体外，阿霉素治疗会致使初生大鼠心肌细胞肥大，并伴随着心肌细胞体积和细胞蛋白含量增加（Tu 等人, 2002）。在这个过程中所涉及的分子机制从未被深入研究。 本研究的目的在于探究阿霉素诱导心肌细胞肥大过程中涉及钙依赖磷酸酶活化程度。采用 H9c2 大鼠心肌细胞和钙依赖磷酸酶的药理抑制剂环孢素A（CsA）和FK506，我们发现，尽管钙依赖磷酸酶被阿霉素处理激活 ，但对阿霉素诱导的细胞肥大不必要。进一步探究在阿霉素导致细胞肥大过程中可能的信号参与通路，揭示了磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶 (PI3K)Akt信号通路的关键作用。 材料与方法 材料与试剂 阿霉素，环孢素A，和胰岛素样生长因子-1（IGF-1）均购自Sigma公司（St. Louis, MO）。FK506源自PKC制药公司（Woburn，MA）。LY294002源自Calbiochem公司（La Jolla，CA）。钙调神经磷酸酶底物RII购自Bachem公司（King of Prussia, PA)）。其他试剂均为Sigma公司，且至少是分析级量。使用的抗体及其来源如下：抗磷酸化Akt（Ser473）是细胞信号转导技术公司（Beverly, MA），Akt抗体和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）抗体均来自 Santa Cruz生物科技公司 (Santa Cruz, CA)。 细胞培养与治疗 来自于美国培养保藏公司（Manassas, VA）的胚胎大鼠心肌细胞H9c2，培养在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM; Invitrog