苹果中多酚氧化酶.pptVIP

苹果中多酚氧化酶的性质 主讲人：马烨 制作人：马烨 前言 主要内容 1. 1 　材料 1. 2. 2 1. 2. 3 　酶活影响因素测定 3) 两种底物同时存在时对酶促反应的影响:配制不同浓度的42甲基儿茶酚溶液, 分别含有0 , 0. 25 ,0. 5 ,1 mmol/ L 咖啡酸,在最适条件下测定多酚氧化酶的酶活;配制不同浓度的绿原酸溶液,分别含有0 ,2. 5 ,5 mmol/ L 儿茶素,在最适条件下测定多酚氧化酶的酶活. 2 　结果与讨论 2. 2 　pH对多酚氧化酶的影响 2. 3 　两种底物同时存在时多酚氧化酶对其氧化的协同作用 2. 4 　对酶的抑制效应　 3 　结　论 马烨 * LOGO 　苹果中多酚氧化酶是引起苹果及其深加工产品———苹果酒褐变的主要因素之一. 苹果品种不同,酶活不同,因此要想以更有效的方式控制酶促褐变,了解在具体储藏条件下的褐变机理需要对酶特性有更深入的了解. 利用乳化剂( Triton2X100 ) 和酚结合剂2聚乙烯吡咯烷酮(PVPP) 相结合的方式提取PPO ,解决了单纯用丙酮粉预处理而导致的酶特性的改变[1 ] . 由于PVPP 的使用,避免了酶的粗抽提物中内源性物质和醌的存在,减少了其同酶的反应而导致的酶失活. 酶促作用的底物不同,引起褐变的程度也不同. 目前报道较多的是苹果中多酚氧化酶对单个底物的作用,对两种底物同时存在时, PPO 对其协同作用的酶促氧化动力学研究甚少. 主要研究了酶的性质和两种多酚底物同时存在时,酶对底物协同影响的作用,从而更加清楚了解褐变同底物及酶的关系,并且对不同抑制剂的抑制效应进行了初步研究. 1 　材料与方法 2 　结果与讨论 3 　结　论 样品: 市场选购精品红富士苹果; 仪器: UV23000 紫外可见分光光度计,日本东芝公司制造; pH2S 酸度计,上海轻工机械厂产品;HIMOL/ LAC Cen2t rifuge SCR20BC 高速离心机,日本日立公司制造. 1. 2 　方法 1. 2. 1 　PPO 的抽提1 称取20～30 g 去皮的苹果, 溶于0. 2 mol/ L 磷酸缓冲液中(含适量的PVPP 和 Triton2X100) 用高速打浆机粉碎, 在4 ℃条件下 12 000 r/ min离心30 min ,用干酪布过滤. 在上清液 中缓慢加入1. 6 倍体积的冷冻丙酮( - 13 ℃) , 9 000 r/ min中冷冻离心15 min ,将沉淀物溶于含适 量Triton2X100的0. 2 mol/ L 磷酸缓冲液中,再次离 心,上清液在- 40 ℃冷藏至少一周. Identity ty Creativity PPO 活性的测定1 于25 ℃、pH 6. 5 时,在 给定的波长条件下,用双光束UV23000 光电检测器 测量通过吸收速率的提高来检测酶活. 酶活单位: 在测定条件下,吸收值变化0. 001 个单位定义为一 个酶活. 儿茶酚、( + )2儿茶素、42甲基儿茶酚、L2酪 氨酸分别采用波长420 nm , 绿原酸采用400 nm. 反 应混合物中含3. 0 mL 的底物溶液和不同量的酶, 空白样中只含底物溶液. 活性曲线的直线部分作为 时间函数来衡量酶活(U/ (mL·min) ) . 反应速度为 单位时间内酶活的变化量. 当出现延迟阶段时,反 应速率由延迟阶段之后的部分进行测量. . 1) pH 对酶活影响:配制0. 05 mol/ L 磷酸缓冲 液,pH 分别为4 ,4. 5 ,5 ,5. 5 ,6 ,6. 5 ,7 ,7. 5 ,8 ,以20 mmol/ L 42甲基儿茶酚为底物,用上述方法测定多 酚氧化酶的酶活. 2) 温度对酶活的影响:配制0. 05 mol/ L pH 4. 5的磷酸缓冲液,分别在不同的温度: 25 ℃,30 ℃, 35 ℃,40 ℃等,分别相隔5 ℃直至80 ℃,以20 mmol/ L 42甲基儿茶酚为底物,测定多酚氧化酶的酶活. 4) 抑制剂对酶活的影响:以20 mmol/ L 42甲基儿茶酚为底物,在最适条件下测定不同抑制剂对多酚氧化酶的抑制效应. 主要内容 2. 1 　不同底物的动力学参数测定 以不同底物测定酶促反应的动力学性质,以42 甲基儿茶酚为例,其米氏方程见图1. V 为反应速度; S 为底物浓度 图1 　42甲基儿茶酚的米氏方程( pH6. 5 ,25 ℃) 　表1 表明,对于苹果中的多酚氧化酶,不同底 物的Km , V m 不同. 多酚氧化酶对表儿茶素的亲和 力最大( Km 最小) ,其次是42甲基儿茶酚、儿茶素和 绿原酸. 但表儿茶素的V m 却最小, 只有21. 24 U/ min. 综合考虑V m 与Km , 42甲基儿茶酚以 V m/ Km最大