《分子生物学检验技术》实验指导.docVIP

实验 小鼠肝组织DNA的提取 【实验目的】 掌握动物组织DNA提取的方法；掌握紫外分光光度法检测、鉴定DNA浓度和纯度的方法【实验原理】 获得相当纯度和完整性的基因组DNA，可用于DNA酶切图谱、多态性分析、基因诊断、构建基因组文库等。因此，DNA样品质量的好坏将直接关系到实验的成败。较理想的DNA样品应达到以下三点要求：①不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②最大程度地降低蛋白质、多糖和脂类分子的污染；③排除RNA分子的污染和干扰。 DNA以核蛋白形式存在于细胞中，提取DNA的原则是即要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等成分分离，又要保持DNA分子的完整。本实验中，用阴离子去垢剂十二烷基磺酸钠（SDS）消化破裂细胞膜、核膜，并使组织蛋白变性沉淀，DNA从核蛋白中游离分开；为控制组织中脱氧核糖核酸酶（DNase）对DNA的降解，加入柠檬酸钠或乙二胺四乙酸二钠（EDTA－Na2）以除去激动该酶的金属离子，SDS也能使DNase变性失活；分离后的DNA用饱和酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染；最后用无水乙醇沉淀DNA，得到欲提取的基因组DNA。260nm处DNA有最大吸收峰，测DNA的A260，可计算其浓度。而蛋白质在280nm处有最大吸收峰，可测定A260nm/A280nm比值，检测DNA的纯度，该比值介于1.8~2.0之间。【实验器材和试剂】 、小白鼠 、设备 移液器台式离心机水浴箱陶瓷研钵等751紫外分光光度计、试剂 1）基因组DNA提取试剂盒（北京康为世纪生物科技公司）：包括Buffer CL、Buffer PP、Buffer GE、RNase A、Proteinase K （7）生理盐水，4℃贮存 无水乙醇【操作步骤】 1、制备肝匀浆 迅速处死小白鼠，称取新鲜肝脏组织，用冷生理盐水洗去血液，滤纸吸干后剪碎组织，于组织匀浆器或研钵中磨μl Buffer CL。将肝匀浆液放入EP管，加入1.5 μl蛋白酶K，漩涡震荡10 s，55℃孵育直到组织溶解（约1小时）。 2、提取DNA（1）μl RNase A，颠倒混匀，37℃孵育15-60 min。 （2）。 （3） （4），可见絮状沉淀（纤维状DNA）从溶液中析出 （5）μl 70％乙醇，颠倒数次以洗涤DNA沉淀。12000 rpm离心1 min，弃上清，室温干燥15 min。 （6）加入50 μl Buffer GE溶解DNA（如果DNA的量比较大，可以65℃孵育以促进DNA的溶解），室温保存待测。取ml DNA样品，蒸馏水，在751紫外分光光度计上测A260值和A280值。 计算：DNA浓度（μg/ml）= A260×50× （请问系数50是如何得来的？） DNA纯度 = A260nm/A280nm【注意事项】 （1）由于DNA主要存在于细胞核内，为便于提取DNA，肝脏的破碎要严格控制好。即要尽可能的将细胞膜破碎，又要尽可能多保留完整的细胞核，以保留60～70％的完整细胞核为宜。为避免DNA过度断裂，不宜用电动研磨器制备匀浆。 在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提，混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。 （2）用氯仿除去组织蛋白，要不断振荡使蛋白质变性。 （3）酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应避免接触皮肤。 （4）室温下干燥时尽可能使残留的乙醇挥发掉（DNA中残留的乙醇会影响内切酶的活性或电泳时DNA不下沉），但不要让DNA完全干燥，否则极难溶解，DNA溶解过程通常需要12-24hr。 （5）提取过程应尽量保持低温。在波长260nm紫外线下，1OD的光密度值相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA或RNA为40μg/ml；单链寡核苷酸为20μg/ml。据此来计算核酸样品的浓度。紫外分光光度法只用于测定浓度0.25μg/ml的核酸溶液。 A260nm/A280nm比值应介于1.8~2.0之间，若比值2表示DNA样品中含有较多的RNA，如比值1.8表明样品中有蛋白质污染。应根据后续实验要求，采取不同的方法纯化。当然也会出现DNA溶液中既含蛋白质又含RNA，其比值介于1.8~2.0的情况，所以有必要结合凝胶电泳等方法鉴定有无RNA，或用测定蛋白质的方法检测是否存在蛋白质。【】 1、A260 = ，A280 = 。 2、小鼠肝组织中DNA浓度是 μg/ml。3、小鼠肝组织中DNA的A260nm/A280nm比值是 。【思考题】 提取和纯化的真核组织DNA有何用途？你的A260nm/A280nm比值结果是否介于