[WesternBlot蛋白质双向电泳]解析.pptVIP

（1）样品制备： 为什么要进行样品制备？ 蛋白质双向电泳一般只能分辨到1000-3000个蛋白质点。 待研究样本常是各种细胞和组织混杂，而蛋白质组研究的通常是单一的细胞类型。 （2）IPG条重泡涨及上样：取大约30-60 μg的蛋白与溶胀液混合，总体积为250 μL。 （4）IPG 胶条的平衡 平衡缓冲液Ⅰ 含DTT 使变性的非烷基化蛋白处于还原状态 平衡缓冲液Ⅱ 含碘乙酰胺 使蛋白质巯烷基化，防止其在电泳过程中重新氧化 硝酸银染色 优点：灵敏度高， 缺点：重复性差，质谱兼容性低 考马斯亮兰染色： 优点：重复性好，质谱兼容性高 缺点：灵敏度低 荧光染色： 优点：重复性好，质谱兼容性高、灵敏度高 缺点：价格贵 其它染色方法： 胺基黑染色、印度墨水染色、金属盐负染等 （7）成像及图像分析 典型流程 凝胶图像的扫描 图像加工 斑点检测和定量 凝胶配比 数据分析 数据呈递和解释 2-DE数据库的建立 注意事项 （1）根据预分离蛋白质的相对分子质量范围确定使用的凝胶的浓度。 （2）凝胶染色方法众多，其主要区别是灵敏度不同，需根据实际需要选择。通常考马斯亮蓝染色能检测到约含量为1 μg的蛋白质点，硝酸银染色法能检测到含量为ng级的蛋白质点。 （3）离子是等电聚焦过程中比较大的干扰因素，在实验过程中应该尽量避免引入离子。如蛋白质提取方法的确定，使用去离子水等。 （4）如果双向电泳分离的蛋白质点需进行质谱鉴定，那么需要注意选择对质谱没有干扰的染色方法。 （5）重复性是双向电泳需要注意的问题之一，所以在操作过程中应保持试剂、操作过程、实验条件的一致性，以确保双向电泳的重复性，从而获得可靠的可比性。 * Western Blot 蛋白质双向电泳 小组成员：姜洪扬 张富赟 贺博 刘宇星 旷亦瑾 韦雨 石岸灵 丁冬 林琼 王祖佳 赵俊雅 概念 Western Blot Western blot是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质检测方法，又称蛋白印迹或免疫印迹，用于检测固定在固相基质上的蛋白质，是当代分析和鉴定蛋白质的最有效的技术之一。 基本原理 Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。 Western Blot 操作步骤 1.蛋白质样品制备 在细胞悬液中加入含蛋白质酶抑制剂的蛋白质抽提液，破碎细胞，离心后收集上清液并测定蛋白质浓度。 Western blot 操作步骤 2.SDS法分离 SDS-聚丙酰胺凝胶电泳（SDS）技术是分离蛋白质的常用技术之一。先配制30%的丙烯酰胺和2%的甲叉双丙烯酰胺储备液，再制备分离胶和浓缩胶。（先制备分离胶，带分离胶聚合后，再制备浓缩胶，并插上梳板。） Western blot 操作步骤 3.蛋白质转膜 电泳结束后，把凝胶浸泡在膜缓冲液中 ，轻轻摇动20min，以去除凝胶上吸附的电泳缓冲液中的盐与去污剂。依次在半干型电泳转移槽正极板上铺两层正极缓冲溶液Ⅰ湿滤纸，一层正极缓冲液Ⅱ湿滤纸，膜、凝胶、三层负极缓冲液湿滤纸。在膜上做好标记以便定位，并驱除每层间的气泡，盖上负极板，接通电源进行转移。 Western blot 操作步骤 4.封闭 标记抗体与膜上蛋白质抗原杂交 封闭主要是为了降低抗体与膜的非特异性结合。把膜浸泡在封闭液中，4°C轻轻摇晃过夜。 Western blot 操作步骤 5.检测并分析标记物信号 ①一抗（鼠抗人）以1:1000比例稀释与20 ml抗体稀释液中，加于膜上，室温1~2h。 ②洗去游离的一抗后，加入生物素连接的 二抗（羊抗鼠，1:1000稀释）室温1h。 ③洗去二抗后，加入Avidin（抗生素蛋白）-生物素辣根过的氧化物酶（HRP）反应30~60min，使二抗、Avidin、生物素化HRP充分结合。 ④洗去游离的HRP后，立即用ECL化学发光剂进行信号检测。 Western blot 操作步骤 Western blot 应用 Westernblot法应用分子生物学、