琼脂糖凝胶电泳技术的原理和方法要点分析.ppt

* * * Tris-硼酸（TBE） Tris-乙酸（TAE） Tris-磷酸（TPE） DNA的泳动受到电泳缓冲液和离子浓度的影响。 缺乏离子，电导率严重降低，电泳迁移率很慢；离子强度过高，电导率升高，极易产生大量的热能，最严重的结果是凝胶熔化，DNA变性 常用的电泳缓冲液有TAE，TPE和TBE,其中TAE的缓冲容量最低，长时间电泳将被消耗。 * * （配制浓度依照所提质粒的大小来确定）. 配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。 * * * * * 实验三琼脂糖凝胶电泳技术的原理和方法 主讲教师和实验员：张运峰 一 实验目的 学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法 检测碱裂解法提取质粒的结果 检测双酶切法鉴定重组质粒的结果（后续实验） 检测PCR法鉴定质粒的结果（后续实验） 二 实验原理 （1）某物质在电场作用下的迁移速度叫做电泳的速率，电泳的速率与核酸分子大小和构型有关。 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。分子质量越小跑得越快，紧密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而可以分离大小不同的DNA或RNA分子。 （2）琼脂糖是一种线性多糖聚合物，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。 琼脂糖浓度(%) 线型DNA分子的分离范围(Kb) 0.3 5～60 0.6 1～20 0.7 0.8～10 0.9 0.5～7 1.2 0.9～6 1.5 0.2～3 12.0 0.1～2 配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。琼脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。 （3）溴化乙锭为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可判断DNA分子量大小和粗略估计样品DNA浓度。 表1 琼脂糖凝胶的浓度与DNA分子大小的关系 三 仪器、材料与试剂 1.质粒样品、酶切样品和PCR样品。 2.凝胶电泳系统和电泳图像分析系统(凝胶成像系统)等。 3.琼脂糖、 1XTAE电泳缓冲液、Goldview、 6X载样缓冲液 （ 6X loading buffer）和DNA分子量标准（Marker ）等。 1.凝胶电泳系统 DYY-6C型 ?双稳定时电泳仪电源（北京六一） 输出范围（显示分辨率）：6-600V(1V)???? 4-400mA?(1mA)????240W 美国Bio-rad伯乐 小型水平电泳槽Mini-Sub Cell GT Cell ?2.凝胶成像分析系统 3.Marker 一个已知分子质量的DNA样品做最对照，用来确定待测样品的相对分子质量。 4.常用电泳缓冲液 缓冲液 缓冲容量 迁移速度 分辨率 用途 TAE 最低 最快 (高10％) 高分子量高 高度复杂DNA混合物；超螺旋DNA TBE 很高 较慢 低分子量高 价格昂贵，不常用 TPE 电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。作用： ①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。 ②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。 ③使样品呈色，使加样操作更方便。 5.上样缓冲液 4.常用核酸染料 名称 优点 缺点 EB （溴化乙锭） 染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中或胶中。 EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。 EB废液要经过处理才能丢弃。 Gldview 低毒，灵敏度较高的染料；可以加入样品中。dsDNA呈现绿色荧光,而ssDNA呈红色荧光,能较好地区分dsDNA与ssDNA。 价格稍高，灵敏度 较低。背景强烈。 SYBR 新型低毒，高灵敏度染料，可以加入样品中。 价格昂贵。对小于50 bp染色缺失，小于100的染色效果较差。稳定性差 Genefinder 花青类染料,毒性很低；最大吸收峰为 470nm。具有安全、灵敏、经济的特点 重复性较差。能引起有机体突变。 溴化乙锭 溴化乙锭（ 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐EB），EB染色（EB可很好地掺入到双链DNA中），在紫外光下会发出橙红色的荧光，用于对DNA进行染色和观察。 用于观察的紫外光有３种波长，一般使用中波紫外光（302nm）。短波紫外光（254nm）观察效果较好，但对DNA的破环很大。长波紫外光（366nm）：回收。 1.制备琼脂糖凝胶（1%） 2.制备凝胶板 3.加样 4.电泳 5.染色 6.结果观察 四.实验步骤 1.制备凝胶