生物技术大实验自制教程分析.pptVIP

实验一、PCR技术及应用 实验原理 多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于DNA的天然复制过程。可简述为： 在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板DNA，四种脱氧核苷酸（dNTP），和耐热Taq聚合酶及两个合成的DNA引物，并有Mg2+存在。 实验原理 加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。 降低溶液温度，使合成引物在低温（56℃）与模板DNA互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。 溶液反应温度升至中温（72℃），在Taq酶作用下，以四种dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。 如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温复性和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并且在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA而参与DNA的合成，使产物DNA的量按2n方式扩增。经过25～35个循环，DNA扩增倍数可达106～109。 实验原理 实验目的 本实验以食蟹猴人芽囊虫虫DNA为模板，设计引物，扩增出1100 bp的扩增产物。学习并掌握PCR 反应的基本原理与实验技术。 器材和试剂 器材 PCR扩增仪，旋涡振荡器，台式离心机，加样枪及枪头等 器材与试剂 试剂： 1、蓝色帽管：天根2×Taq MasterMix(内含Taq DNA 聚合酶、 dNTP 、Mg＋＋和上样buffer等） 2、白色管：引物 1 引物 2 3、白色管：无菌ddH2O 4、模板DNA：人芽囊虫基因组DNA 操作 无菌ddH2O 8 ul 2×Taq MasterMix 10 ul 引物1 0.5 ul 引物2 0.5 ul 模板DNA 1ul 总体积 20 ul 混匀后，高速瞬时离心 ，置PCR仪上 操作 PCR扩增的设定： 设置PCR扩增仪的热盖温度为99℃ 预变性：94 ℃4min 循环： 95℃变性45s 54℃退火 45s 35个循环 72℃延伸1min 最后延伸：72℃ 5min 产物进行电泳拍照。 注意事项 由于PCR技术非常敏感，可使一个DNA分子得以扩增，装有PCR试剂的微量离心管打开之前，应先在微量离心机上作瞬时离心使液体沉积于管底。 最好在加完所有其它反应成分后才加模板DNA，加模板DNA时不要形成喷雾。 若用没有热盖的PCR扩增仪，则需在反应体系中加入液体石蜡等矿物油封闭体系以防止反应过程中液体的蒸发。 【思考题】 1、PCR反应的原理是什么？ 2、PCR反应体系包括那些？ 能自主复制； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 具有两个以上的遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 质粒的复制型 质粒在细胞内的复制一般有两种类型: 严谨型(Stringent control) ：只在细胞周期的一定阶段进行复制，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒 松弛型(Relaxed control) ：质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制停止后，质粒仍然能继续复制，每个细胞中含有10-200个拷贝。 实验目的 掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各主要试剂的作用。 提纯的思路 质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA 要去除的物质： 　蛋白 　基因组DNA 　RNA 实验原理 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们。 在碱性pH，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条链不会完全分离。 当用pH4.8的KAc或NaAc高盐缓冲液调节其pH值到中性时，质粒DNA分子能够迅速准确地复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；而线状染色体DNA则不能复性，形成缠绕的网状物，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物一起沉淀下来而被除去。 再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA，用无水乙醇沉淀质粒DNA。 实验仪器与材料 （一）仪器：超净工作台，恒温摇床，台式离心机，高压灭菌锅 （二）材料：1.5ml 离心管，加样枪，含有质粒pVAX1的大肠杆菌TOP10 、LB液体培养基 DNA的保存 1、短期贮存：