第四讲基因工程.pptVIP

DNA上的酶切位点 pUC18与 pUC19的多克隆位点序列 5、影响限制性核酸内切酶消化的因素 DNA的纯度 DNA甲基化程度 温度 缓冲液 ：Mg2+ （二）DNA连接酶 1.功能：催化DNA双链5‘磷酸基与3’羟基之 间形成磷酸二酯键。 2.种类：T4DNA连接酶、细菌DNA连接酶。 3.作用温度：最适37℃，通常16℃左右。 DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 逆转录酶 碱性磷酸酶 末端脱氧核苷酰转移酶 （三）修饰酶 1。DNA聚合酶Ⅰ(pol Ⅰ)的活性 5′→3′的聚合活性 5′→ 3′方向 核酸 外切酶活性 5′→ 3′外切酶活性 3′→ 5′外切酶活性 pol Ⅰ经枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段 大片段 （Klenow片段）：聚合活性、 3′→ 5′外切活性 常用的工具酶用于测序、探针标记等。 2。Taq DNA聚合酶： 耐高温，具有聚合及3′→ 5′外切酶活性。常用于PCR扩增。 三、基因工程载体 （一）定义： 能将有用基因携带至宿主细胞并可在其中自主复制的遗传因子。 即：能携带靶DNA进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。其本质是DNA。 （二）理想克隆载体的条件 能自主复制和增殖 易进入宿主细胞 有合适的酶切位点方便组装外源DNA 具有筛选标志和识别指标 （三）种类： 质粒 噬菌体DNA 病毒DNA 1.质粒载体 质粒——细菌染色体以外的，能自主复制的，与细菌共生的，同时对细菌的表型有一定影响的遗传物质。 特点——双链环形 严紧复制或松弛复制 对宿主存活不必需 人工质粒载体 严紧型质粒载体 松弛型质粒载体 类型： 天然质粒载体 例 1 pBR322 特点： 分子小，松弛型 含常用酶切单切点 有Ampr和Tcr抗性基因作为筛选标记 例 2 pUC18 （多克隆 位点） pUC18与 pUC19的多克隆位点（多种酶切口、单一酶切点）序列 2、λ噬菌体载体 结构特点 a、线性双链DNA分子， b、其末端有12bp的互补单链，称为cos位点，是λDNA包装成为噬菌体颗粒不可缺少的序列。 野生型λ噬菌体的cos位点序列为： ——CCCGCCGCTGGA5′ 5′GGGCGGCGACCT—— λ噬菌体(λphage) 基因组分三个区域：左侧区、中间区（非必需区）、右侧区 DNA，替换型载体，外源DNA：9~23kb 常用：EMBL 系列、 λgt 系列、charon系列 科斯质粒(cosmid)： λDNA的 cos区+质粒，双链 环状DNA，克隆容量：40~50kb 常用的噬菌体载体 3、真核基因病毒载体 SV40病毒 牛乳头瘤病毒 腺病毒 4.酵母人工染色体载体(YAC) YAC(yeast artificial chromosome)载体是大容量的载体，可供插入的外源基因片段长度是200～1000kb，甚至更长。YAC已经成为人类基因组研究中的重要工具。 哈哈， 下 课 了 ! 第四章 基因工程 基因工程定义 常用工具酶 载体 一、基因工程定义 1.定义 基因工程是指将外源基因通过体外重组后，导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。 2.基因工程核心技术： DNA克隆技术（又称为DNA重组技术、分子克隆技术） 具体过程：应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（重组体）。 基因克隆的技术路线 基因 载体 体外重组 重组子（杂合DNA） 转化 受体细胞 筛选阳性克隆 大量扩增，获得子代DNA 基因克隆示意图 （蛋白质） 3.基因工程要件 工具酶 （限制性内切酶、连接酶、聚合酶等） 目的基因（外源基因） 载体 （质粒、噬菌体DNA等） 受体细胞 （大肠杆菌、酵母菌、动物细胞等） 基因工程、 遗传工程、 基因操作、 重组DNA技术、 基因克隆、 分子克隆 重组DNA技术进展 1973 Cohen第一例成功的克隆实验 1978 Genentech公司 人胰岛素 世界上第一种基