Folin酚法测定蛋白质含量.docVIP

实验报告 综合试验（三） Folin-酚法测定蛋白质含量 2010年6月3日 摘要：本实验包括两个步骤，第一个步骤为制作标准曲线，第二个步骤为制备样品（牛奶和酪蛋白粗制品）并用Folin—酚法进行蛋白质含量的测定，得到酶原液蛋白含量为8923 (ug/ml)；洗脱峰Ⅰ蛋白含量82.692(ug/ml)；洗脱峰Ⅱ蛋白含量121.923(ug/ml)；洗脱峰Ⅲ蛋白含量83.077(ug/ml)。此次实验与理论值仍存着一定的偏差。通过本次实验的操作以及对实验结果的分析，了解Folin—酚法准确测定蛋白含量的原理方法，以及其相关的影响因素。 一、实验目的： 1、测定实验中原液和洗脱液中蛋白质的含量 2、掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法。 3、熟悉分光光度计的操作。 二、理论背景： Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin试剂）还原，产生深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100倍，定量范围为5～100μg蛋白质。Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。 三、实验装置： 1．实验材料 原液， 洗脱峰 2．仪器 （1）移液管（0.5mL、1mL、5mL） （2）量筒 （3）分光光度计 （4）移液管、移液枪 3．试剂（纯度均为分析纯） （1）0. 5mol/L NaOH (2) 试剂甲：（A）称取10g Na2CO3，2g NaOH和0.25g酒石酸钾钠，溶解后用蒸馏水定容至500mL。（B）称取0.5g CuSO4·5H2O，溶解后用蒸馏水定容至100mL。 每次使用前将（A）液50份与（B）液1份，即为试剂甲，其有效期为1d，过期失效。 （3）试剂乙：在1.5L容积的磨口回流器中加入100g钨酸钠（Na2WO4·2H2O）和700mL蒸馏水，再加50mL 85％磷酸和100mL浓盐酸充分混匀，接上回流冷凝管，以小火回流10h。回流结束后，加入150g硫酸锂和50mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15min，驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色（倘若仍呈绿色，再滴加数滴液体溴，继续沸腾15min）。然后稀释至1L，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存，使用前大约加水1倍，使最终浓度相当于1mol/L。 （4）标准牛血清白蛋白溶液：在分析天平上精确称取0.0250g结晶牛血清白蛋白，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解后转入100mL容量瓶中，烧杯内的残液用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，则配成250μg/mL的牛血清白蛋白溶液。（试剂已配好） 四、实验步骤 1、标准曲线的制作 （1）系列标准牛血清白蛋白溶液的配制：取6支普通试管，按表1加入标准浓度的牛血清白蛋白溶液和蒸馏水，配成一系列不同浓度的牛血清白蛋白溶液，做两组平行。然后各加试剂甲5mL，混合后在室温下放置10min，再各加0.5试剂乙，立即混合均匀（这一步速度要快，否则会使显色程度减弱）。30min后，以不含蛋白质的1号试管为对照，用分光光度计于650nm波长下测定各试管中溶液的光密度并记录结果。 表1 牛血清白蛋白标准曲线制作 试 剂 管 号 1 2 3 4 5 6 牛血清白蛋白溶液（mL） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（mL） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 （2）标准曲线的绘制：以牛血清白蛋白含量（μg/ml）为横坐标，以光密度平均值为纵坐标绘制标准曲线。 2、样品的制备及测定 从分离峰中各取1ml溶液，分别加入试剂甲5ml , 混匀后放置10min，在各加试剂乙0.5 ml，迅速混匀，室温放置30min，于650nm波长下测定光密度，并记录数据。 五、注意事项： 进行测定时，加Folin试剂要特别小心，因为Folin试剂仅在酸性pH条件下稳定，但此实验的反应只是在pH10的情况下发生，所以当加试剂乙（Folin试剂）时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。 六、实验结果： 表1-1 标准牛血清白蛋白标准曲线数据处理 试 剂 试 管 号 1 2 3 4