16HBE plβ基因的RNA干扰及其在氢醌、甲醛攻击下的毒理学效应分析.pdf

16HBE pol13基因的RNA干扰 及其在氢醌、甲醛攻击下的毒理学效应分析 卫生毒理学 博士研究生：胡大林 导 师：庄志雄教授 摘 要 随着工农业生产的飞速发展，环境化学性污染物(ECPs)对人群健康的损伤 倍受各方面的广泛关注，氢醌(苯的代谢产物)和甲醛就是其中的典型代表。近 年来，化妆品和装饰材料涉及到氢醌和甲醛中毒的案件急剧上升，而目前，二者 的毒理学效应和机制又尚未完全阐明。 DNA损伤修复基因位居环境基因组计划(EGP)6大优先考虑的环境应答基因 B)基因就是其中之一“11。目前认 的首位，·DNA聚合酶B(polymerasebeta，pol 为，polB的功能主要涉及碱基切除修复(BER)，即填补由碱基切除所产生的非 常短的核苷酸缺口；同时，还可能参于DNA复制、重组，与基因组的稳定性等密 切相关，但其与环境化学性污染物所致DNA损伤之间的关系有待于进一步研究 [4一¨] 近年来，分子生物学研究中的基因阻断技术发展迅速，其中RNAi与基因沉 默(Genesilencing)现象的发现，为人们所感兴趣的“明星事件”，作为一种 高效、特异的基因阻断技术，RNAi技术正广泛运用于基因治疗、功能基因组研 究、药物筛选、病毒感染研究、信号传导途径研究及分子毒理学研究等领域“2‘“3。 0在人支气管上皮细胞(16HBE)中的表达， 本研究运用了RNAi技术阻断pol B缺陷细胞的生物学性状及其在氢醌和甲醛等环境化学性污染物 以探索人pol (ECPs)攻击下的毒理学效应，为pol0基因的功能研究及氢醌和甲醛的毒作用 机制探索提供基础资料。 主要研究内容和方法 一、运用分子克隆技术构建16HBEB基因RNA干扰用的绿色荧光蛋白载体重 pol 组子“pEGFP—C1一pU6一dsRNA”。 0基因cDNA序列(NM002690)，运用dsRNA 依据Genbank中人pol oligonucleotide 筛选、扩增后抽提质粒，运用EcoR I和BglII消化并回收“pU6一dsRNA”目的片 子，并进行酶切鉴定和序列分析。 二、运用载体介导的RNA干扰技术靶向抑制polB基因在16HBE中的表达。 同时以空白细胞和空载体“pEGFP—CI”转染细胞作对照实验；在经G418筛选后， blot 以荧光显微成像技术观察细胞的转染效果；以蛋白印迹法(Western analysiS)从蛋白水平分析polB基因的抑制效应；以实时荧光定量PCR (Real—time B的表达抑制。 PCR)技术从mRNA水平分析pol 三、经RNA干扰后的16HBE细胞(16HBE一8一)的生物学性状分析。 以细胞形态学、细胞生长曲线、细胞周期及软琼脂糖恶性程度鉴定实验等考 察16HBE—B匍胞的生物学性状改变。 四、16HBE—B一在不同浓度氢醌(HQ)攻击下的毒理学效应分析。 毒后的细胞形态学改变：以MTT法分析不同浓度的HQ对16HBE—B一的细胞毒性； 应。 五、以不同浓度的甲醛对16HBE一13一细胞染毒，分析其毒理学效应。 以不同浓度甲醛对处对数生长期的16HBE-B一细胞染毒4hrs；观察染毒后的 细胞形态学改变；以MTT法分析不同浓度的甲醛对16HBE—B一的细胞毒性；以流 式细胞技术分析不同浓度甲醛对16HBE一13匍胞周期的影响；以SCGE技术分析 不同浓度甲醛对16HBE一13一细胞的DNA损伤程度。 结果 一、16HBE pol 构建。 1．dsRNA寡核苷酸链的设计、合