酵母双杂交自激活现象概述.pptVIP

* For the yeast two-hybrid method we also have a couple of gene constructs necessary..consturcts in yeast expression vectors so when they come into the yeast they are expressed. The first construct is the DNA binding domain of the transcription activator coupled to DNA coding for our protein X. When this gene comes to expression we get a hybrid protein…X plus DNA binding domain. The second gene construct is the activator domain coupled to DNA coding for protein Y. When this gene comes to expression we get another hybrid protein..Y plus the activator domain. Thus the name “two-hybrid”. Now the question: Do we get expression of our reporter. If X can bind to Y the yeast cell can construct an effective transcription activator, which can then bind to the UAS and bring about gene expression. Thus, through the yeast two-hybrid system, and these two hybrid proteins we have answered our question. We have expression of the reporter gene and thus the two proteins do bind. 酵母双杂交自激活现象 真核生物的转录因子是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。 一、原理 酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。 GAL4分子的BD可以同上游激活序列(upstream activating sequence,UAS)结合。 AD则能激活UAS下游的基因进行转录。 单独的BD和AD都不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活功能。 His, β-gal 一般情况下，单独的 BD 可以与 GAL4 上游活化序列（GAL UAS）结合，但不能引起转录。然而，将一段具有转录激活活性的转录因子基因构建到BD载体上，若其表达产生的 BD 单独与 UAS 结合也可以引起下游报告基因的转录，那么就称之为酵母双杂中的自激活现象。反过来，可以利用这种自激活现象来验证某个转录因子是否具有转录激活活性。 His, β-gal 自激活原理 Transcription factors GAL4BD YPDA 液体 500ml 固体 100ml 蛋白胨 10g 2g 酵母提取物 5g 1g 琼脂 —— 2g 0.2%ade 10ml 2ml 葡萄糖 10g 2g YPDA培养基 0.2g ade定容至 100ml → 0.2%的ade母液 pH 6.5 灭菌 121℃ 15min 正对照：pGAL4 负对照： pBD-GAL4 将-70℃下冻存的酵母菌在YPAD平板上划线，倒置于30℃培养2-3天。 挑取2-4个大菌落（直径2-3mm）于1.5ml YPAD液体培养基中，剧烈震荡5min，打散菌落，接种于50ml YPAD液体培养基中（250ml三角瓶），230-250转/min，30℃培养18-24hr。 取菌液测定其OD600值，需达到1.5。若不到，再培养1~2hr，若还不到，换单克隆重摇。 取50ml菌液于300mlYPAD培养基中（1-2L大三角瓶），30℃，230rpm，摇培3hr，至 OD600值为0.4~0.6。 4000rpm 5min 于常温收集菌体，重复一次。 室温下1000g离心5min