分子生物学实验理论及操作答案概述.docVIP

实验答案 基本原理题 限制性内切酶有那些特点？ ①能识别双链分子的某种特定核苷酸序列 ②使每条DNA链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开 2、限制性内切酶有那些类型，我们DNA重组时常用的是哪类？ 答：限制性内切酶主要分成三大类。 第一类限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中没有多大用处，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。第二类限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。所以总能得到同样核苷酸顺序的DNA片段，并能构建来自不同基因组的DNA片段，形成杂合DNA分子。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、9个、10个和11个核苷酸的。第二类限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式。一是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。第三类限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则是任意的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。这对于克隆基因或克隆DNA片段没有多大用处。 何为细菌的限制修饰系统？ 是一种存在于细菌（可能还有其他原核生物），可保护个体免于外来DNA（如噬菌体）侵入的系统，主要有限制内切酶和甲基化酶组成的二元系统。细菌的限制修饰系统包含三个连锁基因： （1）hsd R：编码限制性核酸内切酶 （2）hsd M：编码限制性甲基化酶 （3）hsd S：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达 大多数限制性内切酶常常伴随有1~2种修饰酶（DNA甲基化酶），后者能保护细胞自身的DNA不被限制性内切酶破坏。修饰酶识别的位点与相应的限制性内切酶相同，它们的作用是甲基化每条链中的一个碱基，而不是切开DNA链。甲基化所形成的甲基基团能伸入到限制性内切酶识别位点的双螺旋大沟中，阻碍限制性内切酶发挥作用。这样，限制性内切酶和它的“搭档”修饰酶一起组成R-M系统。在某些R-M系统中，限制性内切酶和修饰酶是两种不同的蛋白，它们各自独立行使自己的功能；另一些R-M系统本身就是一种大的限制-修饰复合酶，由不同亚基或同一种亚基的不同结构域来分别执行限制或修饰的功能。 说说热激转化法和电击转化法的区别。 电击法：使用瞬时高压电（数千伏特）处理细胞悬液，微生物细胞膜在高压电的作用下发生去极化，产生微孔，悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的孔洞进入细胞内部。化学法：使用低渗溶液处理细胞悬液（0.1M CaCl2），微生物细胞膜结构会发生一些变化，使得细胞在热激时（42度90秒）变得很容易从溶液中摄取DNA。具体机理目前仍然不是十分清楚，但是很有效。 做电击转化时，悬液中有近70%的细胞会因电击而死亡，但是这种方法很直接，转化效率很高。当需要高的转化效率时，比如制作基因文库，可以采用电击转化，另外，做酵母等真核生物转化时一般都是电击。化学转化法操作简单，不需要特殊设备，转化效率足以满足一般克隆实验的需要，故使用范围非常广。 碱裂解法提取质粒的基本原理是什么？ 在碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA的氢键断裂，致使宿主染色体DNA变性，但闭合环状的质粒DNA由于拓扑缠绕而不能彼此分开。当以pH 4.0的NaAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，质粒DNA迅速恢复原有的构型，重新形成超螺旋分子，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性，形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 CsCl密度梯度离心的原理是什么？ 将质量差异微小的分子分开。用氯化铯浓盐液，以105g以上的强大离心力的作用，盐的分子被甩到离心管的底部。同时，扩散作用使溶液中Cs＋和Cl－离子呈分散状态，与离心力的方向相反，经过长时间的离心，溶液达到一种平衡状态。反向扩散力与沉降力之间的平衡作用，产生了一个连续的CsCl浓度梯度。离心管底部溶液的密度最大，上部最小。DNA分子溶于CsCl溶液中，经过离心，将逐渐集中在一条狭窄的带上。带上的DNA分子密度与该处CsCl相等。 7、质粒载体具备的基本要素是什么？ 是染色质外的双链共价闭合环形DNA能自主复制，是能独立复制的复制子质粒对宿主生存并不是必需的必须包括三部分：遗传标记基因