分子生物学研究法概述.docVIP

分子生物学研究法 5．1 重组DNA技术发展史上的重大事件 2 5．2 DNA操作技术 5 5．2．1核酸的凝胶电泳 5 5．2．2核酸的分子杂交 6 5．2．3 细菌转化 7 5．2．4核苷酸序列分析 7 5．2．5 基因扩增 10 5．2．6 DNA与蛋白质相互作用研究 11 5．3 基因克隆的主要载体系统 12 5，3．1 质粒DNA及其分离纯化 12 5．3．2 重要的大肠杆菌质粒载体 13 5．3．3 λ噬菌体载体 15 5．3．4柯斯质粒载体 17 5．3．5 pBluescript噬菌粒载体 17 5．4 基因的分离与鉴定 18 5．4．1 DNA片段的产生与分离 18 5．4．2 重组体DNA分子的构建 18 5．4．3 cDNA基因克隆 19 5．4．4克隆基因的分离 20  分子生物学研究之所以从20世纪中叶开始得到高速发展，其中最主要的原因之一是现代分子生物学研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。因此，基因工程技术其实是核酸操作技术的一部分，只不过我们在这里强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。事实上，这种跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其他技术的根本特征。本章将在回顾重组DNA技术史上主要事件的基础上，讨论DNA操作技术、基因克隆的常用载体系统以及基因的分离与鉴定等3个环节。 5．1 重组DNA技术发展史上的重大事件 最近数十年来，分子生物学研究取得了前所未有的进步，概括地说，主要有3大成就：第一，在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；第二，50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了基因的自我复制和世代交替问题；第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。但是，由于缺乏有效的分离和富集单一DNA分子的技术，科学家无法对这类物质进行直接的生化分析。事实上，DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生与发展。 图5-1 几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端 因为重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割与连接，所以，不少科学家认为，这些工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件(表5—1)。限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。1972年，Boyer实验室发现有一种核酸内切酶EeoR I能特异性识别GAATIC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。他们还发现，能够把EcoR I酶切产生的任何不同来源的DNA片段通过粘性末端之间的碱基互补作用而彼此“粘合”起来。此后，大量类似于EeoR I但具有独特识别序列的核酸内切酶被陆续发现(图5—1)。到目前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。表5—2列出了核酸操作实验常用的几大类重要工具酶。 表5-1 重组DNA技术史上的主要事件 年份 事件 1869 F．Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。 1957 A.Komberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶Ⅱ。 1959—1960 Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA，并证明tuRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。 1961 Nlrenberg破译了第一个遗传密码；Jacob和Monod提出了调节基因表达的操纵子模型。 1964 Yanofsky和Brenner等人证明，多肽链上的氨基酸序列与该基因中的桉苷酸序列存在着共线性关系。 1965 Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由“质粒”DNA所决定。 1966 Nirenberg，0choa，Khorana，Crick等人破译了全部遗传密码。 1967 第一次发现DNA连接酶。 1970 Smith，Wilcox和Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶，Temin和Baltimore从RNA肿瘤病毒中