分子生物学实验手册-概述.docVIP

分子生物学实验手册 刘惠荣、李国婧编 内蒙古农业大学生命科学学院 二○一○年五月前 言 二十一世纪的今天，分子生物学技术已不再神秘，它的理论和技术已经渗入生物学的各个分支学科及医药农林的各个分支领域，并衍生出了许多新兴的交叉学科，如分子免疫学、分子微生物学、分子遗传学、分子药理学等，对分子生物学实验技术的掌握已经成为这些学科在新的高度和深度揭示生命奥秘的共同需求。 实验教学是高校教学工作中一个重要的组成部分，是培养学生实践能力和创新能力的重要环节，也是提高学生专业素养和就业竞争力的重要途径。本书是在我们多年用作内蒙古农业大学生物工程学院生物科学专业本科生实验指导讲义的基础上，经修订和改编而成的，可以作为我校生物和农林等专业的分子生物学实验指导用书。 本书以基本的分子生物学实验为主，内容包括植物基因组DNA提取及其定性定量分析、PCR扩增目的片段和胶回收、目的片段和载体的连接、大肠杆菌感受态细胞的制备、重组质粒的转化、质粒DNA的提取及酶切鉴定等六个大实验，每个实验都介绍了实验的基本原理、实验所需仪器试剂、实验操作步骤、注意事项等，为了大家能更好地掌握和理解实验原理及关键操作，在每个实验后面罗列了与本实验相关的复习题。本书的编写宗旨是简明、实用，是一本适合任何具有分子生物学基本知识的学校本科生、研究生或单位工作人员使用的教材。 本书是我们内蒙古农业大学生物工程学院几位老师从教学和科研中不断总结经验而完成的，几位老师为本书的编写投入了大量精力，在此表示感谢。 由于编写本教材的时间仓促，编者水平有限，书中难免出现疏漏之处，希望读者在使用的过程中，对书中的不当之处提出批评指正，不胜感激。编者 200年月 目 录 实验一 植物基因组DNA的提取及其定性定量分析 2 实验二 PCR扩增目的片段和胶回收 8 实验三 目的片段和载体的连接 14 实验四 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化效率检测 17 实验五 重组质粒的转化 19 实验六 菌落的PCR鉴定 21 实验七 重组质粒DNA的提取及酶切鉴定 24 实验一 植物基因组DNA的提取及其定性定量分析 【实验目的】 通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA 并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。 【实验原理】 通过CTAB法提取植物基因组DNA是由Murray和Thompson1980) 修改而成的简便方法。CTAB十六烷基三甲基溴化铵是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度下大于0.7M NaCl，与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，最后经乙醇沉淀得到DNA。 琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质琼脂糖凝胶的样品孔中，并置于静电场上。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此，在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子迁移速率快，迁移距离远，由此得到分离。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently closed circular DNA，简称cccDNA)，开环质粒DNA，即环状质粒DNA的1条链断裂，open circular DNA，简称ocDNA)，线状质粒DNA，即环状质粒DNA的2条链在同一处发生断裂linear DNA，简称L DNA）。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。 核酸分子DNA或RNA由于含有嘌吟环和嘧啶环的共轭双键，在260nm波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。1 OD260相当于dsDNA 50μg/mL，ssDNA 33μg/mL和ssRNA 40μg/mL。可以此来计算核酸样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260nm和280nm的紫外线吸收值的比值A260/A280)估计核酸的纯度，若DNA的A260/A280比值高于2.0，则可能有R