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借助远缘杂交构建大黄鱼微卫星标记连锁图谱 摘 要 本文建立了大黄鱼与黄姑鱼杂交鱼苗的基因组 DNA 扩增技术，以及通用序列加尾与 荧光素标记的微卫星分型技术。利用所建立的技术，以大黄鱼♀×黄姑鱼♂和大黄鱼♂× 黄姑鱼♀杂交初孵仔鱼为材料构建微卫星标记连锁图谱，同时利用诱导的杂交三倍体研究 了32 个大黄鱼Ⅰ型微卫星标记与着丝粒的遗传距离。主要结果如下： 1. 为实现利用Gel-Scan 3000 遗传分析仪准确、自动地记录微卫星标记电泳产物并节 省成本，研究了以添加荧光标记的 M13 引物为通用引物的微卫星标记分析技术。其PCR 体系包含3 条引物：5’端加上M13 通用序列的正向引物、反向引物与M13 引物（5’端标记 一种荧光素），正向与反向引物用量之比为1:10，且正向引物与M13 引物用量之和等于反 向引物用量时扩增效果最好。研究确定了适用于大黄鱼已有微卫星标记的PCR 反应体系、 热循环条件，以及多重上样方法。与普通PCR 及银染显色技术相比，该方法具有高通量、 低成本以及分析精确等优点。 2. 鉴于大黄鱼与黄姑鱼杂交能获得拥有父本和母本单倍体基因组且形态正常的杂交 仔鱼，但仔鱼不能开口摄食和成长，DNA 数量不足以用于遗传图谱构建，因此研究了杂交 仔鱼的DNA 扩增技术。基因组DNA 以Taq Ⅰ内切酶酶切，酶切片段与Taq Ⅰ寡核苷酸接 头连接，然后以该接头序列为引物用高保真DNA 聚合酶对连接产物进行PCR 扩增。采用 这种方法，可使基因组DNA 增加约2.5×107 倍，大部分扩增片段集中在500-1500 bp 之间， 用作大黄鱼微卫星标记连锁图谱构建的PCR 反应模板效果良好，从而解决了用初孵仔鱼构 建遗传图谱DNA 模板不足的问题。 3. 采用纯粹的大黄鱼家系构建遗传图谱，由于亲本间的遗传差异不大，在很多微卫星 位点上都缺乏作图信息，构建高密度图谱有困难。因此本文尝试利用大黄鱼与黄姑鱼杂交 子代进行大黄鱼遗传图谱构建，以期能够对利用纯粹的大黄鱼家系构建的SSR 标记图谱进 行加密。共使用144 尾大黄鱼♀×黄姑鱼♂家系、96 尾黄姑鱼♀×大黄鱼♂家系的初孵仔鱼， 主要选择在纯粹的大黄鱼家系中缺乏作图信息的位点，加上部分已在本实验室构建的大黄 鱼SSR 标记图谱上定位的位点作为锚定标记，共检测了221 个标记，正反交家系中具作图 信息的标记分别有81 个与61 个，能定位到雌雄图谱中的标记分别有43 个与30 个，分别 构成 15 个与 11 个连锁群。构成的雌性图谱总长度529.17 cM，预期长度1138.96 cM，图 谱覆盖率为46.4% ；雄性图谱总长度327.56 cM，预期长度614.48 cM，图谱覆盖率为53.3% 。 雌雄图谱中偏离1:1 分离比的位点分别有5 个与7 个，占总标记的6.1%与11.7%。32 个微 卫星标记可在黄姑鱼基因组中扩增出清晰的条带，其中14 个具有多态性。 I 4. 进行大黄鱼与黄姑鱼杂交，通过抑制受精卵第二极体排出，构建了2 个三倍体家系； 利用这2 个家系研究了32 个大黄鱼Ⅰ型微卫星标记与着丝粒间遗传距离。其中21 个位点 的重组率大于2/3 ，说明这些位点处于与着丝粒距离较远的位置，位点LYC1737 与着丝粒 重组率达0.979 ，显示其可能位于远离着丝粒的染色体的端部区域；LYC3211 与着丝粒重组 率为0 ，表明位置紧邻着丝粒。 关键词 大黄鱼，微卫星连锁图谱，着丝粒，M13-tailed ，基因组扩增，远缘杂交 II Construction of SSR Linkage Maps for Larimichthys crocea by Using distant hybirdization Abstract Whole genome amplification technique, universal sequence tailed and fluorescence labeled microsatellite analysis method by