细菌漆酶LacA在大肠杆菌中的异源表达..pptVIP

六：实验注意事项 3.提取质粒的各步骤都应在低温下进行。 4.在提取细菌基因组DNA时，应注意DNA酶的污染，避免DNA的降解。 等等… 致谢 特别感谢各位老师辛苦的上课，教授我们很多重要的生物学实验方面的知识。 特别感谢本组的每个同学的积极参与。我们深知实验方案有很多不足，希望老师给予批评指正。 参考文献 [1] 肖亚中，洪宇植.长距离反向PCR技术高效扩增已知DNA片段的侧翼序列[J].激光生物学报,2006,15(1):46-49. [2] 肖亚中. 栓菌420漆酶同工酶B基因克隆及异源表达[J].生物学杂志,2007,24(3):25-28. [3]赵敏.细菌漆酶的研究进展[J].中国造纸学报，2008,23(3)：107-114. [4]洪宇植. 新型真菌漆酶的克隆以及表达调控的分子机制.安徽大学硕士学位论文. * * * * * * 细菌漆酶LacA在大肠杆菌中的异源表达 组员（按学号排序如下）： 刘艳红、王瑞、姚伟静、张明珠、康兴、程飞、孙元元、刘燕红、程旭、査倩、潘伟民、傅声祥 汇报人：程飞 一、实验简介 漆酶（Laccase）是一种含酮的多酚氧化酶，能够催化多种酚类和非酚类化合物发生氧化，同时伴随由分子氧还原成水。 漆酶一般由500-600个氨基酸组成，不同来源的漆酶氨基酸序列的相似程度较低，但是其催化位点序列相当保守。对漆酶的晶体结构进行研究，发现其分子具有3个铜离子结合位点，共结合四个铜离子。 野生漆酶的产量低，重组表达是提高漆酶产量的一种常用方法。本实施主要通过由保守区设计简并引物扩增部分漆酶LacA片段，以及反向PCR扩增已知序列临近的未知序列，并且通过序列拼接获得完整的LacA基因序列，并转化大肠杆菌，进行异源高效表达。 二、实验目的 获得细菌LacA基因 。 LacA在大肠杆菌中异源表达。 三、实验原理 DNA重组。 简并引物。 酶。 TA克隆：将3′端具有单个“A”突出末端的PCR产物克隆到3′端具有单个“T”突出末端的载体的克隆法。 反向PCR: 反向PCR是一种新型的基因扩增方法，它能扩增一段已知序列旁侧的DNA。 载体选择。 蓝白筛选： 质粒载体含有大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（lacz）的启动子（受IPTG诱导）及其编码α肽链（β-半乳糖苷酶的氨基末端短片段）的DNA序列（特称为lacz基因）。受体大肠杆菌细胞的β-半乳糖苷酶发生了突变，失去的氨基末端。当lacz基因编码的α肽链同失去了正常氨基末端的β-半乳糖苷酶突变体互补时，便会产生出有活性的β-半乳糖苷酶分子，在IPTG诱导下，会启动表达，分解X-gal产生蓝色背景。当MCS中插入外源基因后，会阻断α肽链合成，不能形成互补，不能产生功能活性的β-半乳糖苷酶，也就不会产生蓝色背景。所以含有重组质粒载体的克隆是白色的。 四、实验材料 1.实验仪器 （1）超微量分光光度计。 （2）制冰机。 （3）高压灭菌器。 （4）PCR仪。 （5）电子天平。 （6）磁力搅拌器。 （7）电泳仪。 （8）冷冻离心机。 （9）高速离心机。 （10）凝胶成像系统。 （11）冷冻研磨仪。 （12）超净工作台。 （13）烘箱。 （14）液氮罐。 （15）pH剂。 2.实验试剂 (1) 载体：质粒pMD18-T，质粒pET-28a（+）。 (2) 产漆酶LacA 细菌。 (实验室自备)。 (3) 限制性内切酶： BamH I ，SalⅠ。 (4) T4 DNA连接酶；TaqDNA聚合酶。 (5) 0.1 mol/L CaCl2溶液。 (6) LB琼脂固体平板 （含Kana）。 (7) LB液体培养基。 (8) 20 mg/mL X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）。 (9) 200 mg/mL IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)。 (10) 琼脂糖。 (11) 无菌双蒸水。 (12)JM109感受态细胞。 (13)卡那霉素50mg/L。 (14)液氮。 (15)合成引物。 (16)PARAFILM。 (17)Tubes。 (18)溴化乙锭。 (19)Agarose。 (20)Sodium chloride。 (21)TRYPTONE。 (22)YEAST EXTRACT。 (23)TE缓冲液T10E1。 (24)甘油。 (25)CutSmart Buffer。 (26)ABTS。 (27)上样缓冲液。 (28)T4 DNA Ligase Buffer。 (29)Trans2K plus DNA Marker。 (30)2XPower Taq PCR Master。 (31)酚/氯仿/异戊醇。 (