抗体工程技术..pptVIP

（三） 细胞融合 融合过程须注意问题 1、细胞比例：骨髓瘤细胞与脾细胞比例为1：4 2、反应时间：混合细胞的离心管中30s内加入1ml 37℃预温的50％PEG，边加边轻轻摇动离心管，作用90s，然后加入预温的37℃的DMEM不完全培养液终止PEG作用，800r/min离心6min，弃上清。 3、培养液成分 * （四）筛选和克隆 有限稀释法(稀释至0.8个细胞/孔) （五） 单克隆抗体的制备和冻存 （六） 单克隆抗体的纯化 （制备方法：体内培养、体外培养） （盐析、凝胶过滤、离子交换层析、 亲和层析、酸沉淀） * ★四 、McA制备的基本方法 * ★五 、单克隆抗体的应用 1、作为亲合层析的配体 2、 作为生物治疗的导向武器 3、 作为免疫抑制剂 通过亲和层析可从复杂的混合物中分离、纯化某一特定成分 McAb所带药物只作用于靶组织器官 抗人的T淋巴细胞单抗用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应 * 4、作为研究工作中的探针 5、增强抗原的免疫原性 6、作为医学检验试剂 （1）诊断各类病原体 （2）肿瘤特异性抗原和相关抗原检测 （3）检测淋巴细胞表面标志 （4）机体微量成分的测定 * CJ PEB1重组蛋白的表达及单克隆/多克隆抗体的制备鉴定 * 课题的思路及目的 诱导培养基因工程菌E.coli BL21(DE3) 高效表达CJ PEB1重组蛋白 镍琼脂糖层析柱纯化 表达后的重组蛋白 免疫BALB/C小鼠制备单抗 免疫新西兰兔制备多抗 为建立血清学方法 检测CJ创造条件 * 一、SDS鉴定纯化后的PEB1蛋白 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 图1. SDS–PAGE鉴定纯化后的PEB1蛋白 表达的蛋白通过镍琼脂糖凝胶层析柱纯化后，经SDS鉴定，蛋白质分子量大小与预计的理论值相符，和本室前期的研究结果一致， PEB1重组蛋白纯度高 。 1～2：咪唑浓度为50mmol/L时洗脱的蛋白 3～4：咪唑浓度为100mmol/L时洗脱的蛋白 5～6：咪唑浓度为200mmol/L时洗脱的蛋白 M ：蛋白质标准分子量 7～8:咪唑浓度为300mmol/L时洗脱的蛋白 9～10:咪唑浓度为400mmol/L时洗脱的蛋白 97.4kd 66.2kd 42.7kd 31kd 14.4kd * PEB1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 常规免疫BALB/C小鼠制备单克隆抗体 * -a -b -c -d -a -b -c -d 抗原决定簇 BALB/C a b b c d 脾脏产生各种 B 細胞 与佐剂乳化 免疫 采血收集血清作为筛选时阳性对照 无菌取脾脏收集B细胞 抗原通常有多个抗原决定簇 免疫后 的脾脏 约在两月內 注射四次 PEB1蛋白 * -d -a -b -c -d PEB1 蛋白 ELISA HAT PEG 细胞融合 杂交瘤细胞 （亚克隆） (确定只有单个细胞) -d -c -b -a -d SP2/0 骨 髓 瘤 细 胞 B cell 脾 细 胞 培养筛选 只识别一个抗原决定簇 a b b c d 合混胞细 选筛 抗单 * 单克隆抗体的获得及鉴定 细胞克隆的形成和杂交瘤细胞的筛选 图2. 融合后第二天骨髓瘤细胞对照孔 图3. 融合后第二天 细胞融合孔 * 图4. 融合后第三天细胞融合孔 图5. 融合后第八天 细胞融合孔 * 图6.间接ELISA筛选抗体阳性孔 * 通过有限稀释法和ELISA法进行连续克隆筛选后获得两株稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株，分别命名为1D7A5株和5G2B3株。 * 图8. 1D7A5株分泌抗体的亚型 图9. 5G2B3株分泌抗体的亚型 * 1D7A5株和5G2B3株杂交瘤细胞诱生的腹水经间接ELISA法检测，腹水中的抗体效价分别为1:8×104和1:5×104。 两株杂交瘤细胞诱生的腹水经双向琼脂扩散试验检测，腹水中的抗体效价均为1:8。 * 运用小鼠单抗分型试剂盒确定杂交瘤细胞所分泌的单抗的亚型。 将建株的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔诱生腹水。 应用间接ELISA法和双向琼脂扩散试验检测的腹水中单抗的效价。通过Western-blot和玻片凝集试验检测单抗的特异性。 * 免疫印迹试验结果显示：2株杂交瘤细胞分泌的单抗，可以与PEB1蛋白特异性结合。通过DAB显色出现特异性条带并且无杂带出现。 1 2 3 4 M 1～2：未经纯化的PEB1蛋白与单抗特异性结合 3～ 4：纯化的PEB1蛋白与单抗特异性结合 M ：蛋白质标准分子量 图