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酶联免疫吸附剂测定 (ELISA) 技术服务部 · 陈XX ELISA的概述 ELISA的基本原理 ELISA的类型 ELISA的特点 ELISA的注意事项 ELISA的应用 目 录 ELISA概述 1971年瑞典学者Engvail和Perlman,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题 ，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术 ELISA基本原理 抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加入酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈色 ELISA的类型 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂： （1）固相的抗原或抗体，即免疫吸附剂 （2）酶标记的抗原或抗体，称为结合物 （3）酶反应的底物。 可设计出各种不同类型的检测方法。 （二）双抗夹心法测抗原 （四）竞争法 （一）间接法测抗体 （三）双位点一步法 （一）间接法测抗体 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的第二抗体（抗体的抗体）以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下： 包被抗原 封闭蛋白 ① 将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原 抗原包被微孔板的制备 ③ 加入封闭蛋白，充填空隙，排除之后步骤中干扰物质的再吸附 ② 洗液洗涤，去掉未吸附的抗原 ④ 洗液洗涤，去掉多余蛋白 加入待测抗体 孵育 洗液洗涤去除其他免疫球蛋白及血清中的杂质 加入酶标第二抗体 孵育 洗液洗涤 （一）间接法测抗体 包被抗原 封闭蛋白 第一抗体 酶标第二抗体 底物 包被抗原 封闭蛋白 第一抗体 酶标第二抗体 底物 加入底物（底物TMB） 孵育显淡蓝色 加入终止液（硫酸）终止反应，变为黄色 用酶标仪测量其吸光值 （一）间接法测抗体 （二）双抗夹心法测抗原 双抗夹心法是检测抗原最常用的方法操作步骤如下： （二）双抗夹心法测抗原 （1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体，加入封闭蛋白，洗涤除去未结合的抗体及杂质 （2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 封闭蛋白 包被抗体 （二）双抗夹心法测抗原 待测抗原 封闭蛋白 （3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与受检抗原的量正相关 酶标抗体 底物 （4）加入底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量 包被抗体 （三）双位点一步法 在双抗夹心法基础上，改为应用针对抗原分子上，两个不同决定簇的两种单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体 优点：测定时标本可与酶标抗体同时加入进行结合反应，两种抗体互不干扰。省时简便。 缺点：当待测抗原浓度过高时，可出现假阴性结果。 （四）竞争法 竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，向抗体包被的微孔板中同时加入受检抗原和酶标抗原，使二者竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。 酶标抗体所用的酶和对应的底物 酶 底 物 显色反应 测定波长 辣根过氧化物酶(HRP) 邻苯二胺四甲基联苯胺（TMB）氨基水杨酸邻联苯甲胺 橘红色黄色棕色兰色 492 460 449425 碱性磷酸酯酶（AP) 4-硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 黄色红色 400500 葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰 黄色深蓝色 405 420 β-Ｄ－半乳糖苷酶 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG) 荧光黄色 360,450420 洗涤液 常用的洗涤稀释液为含0.05%吐温20磷酸盐缓冲液 终止液 常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L ELISA特点 灵敏性高：该测定法的灵敏度来自作为报告基团的酶。酶作为一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反应 ，产生可供观察的显色反应现象，因此该体系常被称为酶放大体系。 特