甘蓝细胞质雄性育系和保持系的同工酶与线粒体DNA的比较研究.pdf

塑童窒些盔耋堡圭耋堡墼塞 垫彗 甘蓝细胞质雄性不育系和保持系的同工酶与 线粒体DNA的比较研究 蔬菜学专业硕士研究生任雪松 指导教师：李成琼 副研究员 摘 要 结球甘蓝(Brassica L)属十字花科芸薹属甘蓝的一个变种。甘蓝的 oleracenvancapitata 杂种优势明显，长期以来甘蓝主要利用自交不亲和系制种。但自交不亲和系的应用存在以下 两方面的缺点：一是长期连续自交会导致后代生活力的衰退，种子繁殖系数下降；二是蕾期 人工授粉，操作麻烦，效率低，且要花费大量的人力物力，增加了制种的成本。如果利用雄 性不育系制种则可克服上述缺点。细胞质雄性不育(CMS)具有保持、转育简便等有利因素， 在杂种优势利用方面有极其重要的意义。通过对基因表达产物——同工酶的研究有助于对不 育机制的了解。同工酶是基因袭达的直接产物，按照一个基因编码一个同工酶亚基的理论， 可以由同工酶的差异直接推测基因型ff勺不同。因此，不育株与可育株在酶谱和活性上的差异， 与不育基因的表达有关。可能是由于不育基因的存在，导致了同工酶基因表达上的不正常， 干扰了物质、能量代谢固有的平衡，最终导致雄性不育。有关细胞质雄性不育系及其保持系 花药同工酶分析的报道已有相当多，但不同作物表现不一样，同一作物不同品种表现也有差 异，而且目前有关甘蓝雄性不育系和保持系同工酶比较研究的报道极少，有关细胞质雄性不 育系与保持系的同工酶分析的报道多限于l一2种酶。本试验对甘蓝细胞质雄性不育系及保持 系花药同时进行四种同工酶分析(过氧化物酶、ATP酶、细胞色素氧化酶、淀粉酶)。 ‘ DNA(mtDNA)水平，线粒体离体翻译产物一蛋白质水平上进行多方面的研究，结果表明mtDNA 与雄性不育有着本质的联系。本研究利用RAPID(随机扩增多态性DNA)技术对甘蓝细胞质雄 性不育系和保持系mtDNA进行分析，其目的是探讨细胞质雄性不育和保持系mtDNA的扩增 差异，为解开细胞质雄性不育之谜积累材料，并为开展雄性不育基因工程。分离育性基因奠 定基础。 本论文以甘蓝细胞质雄性不育系(2001038)和保持系(2001039)为试材，以甘蓝小花蕾期、 大花蕾期及盛花期的花药为试样．采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板不连续电泳技术，分析了不育 系及保持系在不同时期过氧化物酶、ATP酶、细胞色素氧化酶及淀粉酶4种同工酶的谱带差异。 结果表明，不育系和保持系的同工酶存在谱带增减及谱带强弱方面的差异。POD酶同工酶在 甘蓝的花药中不育系不仅在酶带上比保持系多出一条，还在主酶带上存在着差异：在雄蕊发 育过程中．不育系ATP酶同工酶活性逐渐‘1I绛-，而保持系的酶活性却逐渐增强；在雄蕊发育不 I 酉奎塞些奎耋堡圭差笪辇耋 垫彗 同时期，不育系COD酶带数目均比保持系多；在发育不同时期，不育系花药淀粉酶的活性均 强于保持系。 本论文采用了5种方法提取甘蓝线粒体DNA，进行了比较，通过改良．获得了一种提取甘 蓝线粒体DNA的简便方法，即：先差速离心分离纯化线粒体，再裂解，用酚．氯仿一异戊醇(25：24：1) 抽提，最后用乙醇沉淀线粒体DNA。 进行比较。从CY05．05引物扩增产物中找到了不育系和保持系的差异片段，在保持系上有一条 不育系上没有的特异片段，回收该特异扩增片段并将其克隆到pUCm．T载体上进行序列测定， DDBJ十PDB中的455972个序列进行比较，同源性均小于30％，表明该片段为一新发现序列。 这为以后从分子水平研究甘蓝细胞质雄性不育打下了基础。 关键词：甘蓝细胞质雄性不育系保持系同工酶线粒体DNA Ⅱ Author：Ren Xuesong Li