热激启动子AtSP70b的克隆与功能改进研究.pdf

热激启动子AtHSP70b的克隆 与功能改进研究 蔬菜学专业硕士研究生裴华丽 指导教师张兴国(研究员) 摘要 获得或杓建可准确调控的植物基闻启动子而实现对目的基因表达的精确调控，使目的基 因定时、定量和定位的表达，是转基因植物中控制目的基冈表达的主要和有效手段。目前研 究最多的是利用外源诱导物诱导启动基因转录，但这种诱导方式存在物种局限性、药物残留 和成本高等多种缺陷。热激启动于是受温度诱导时启动基因转录，与其他诱导型启动子相比， 它克服了利辟l井源诱导物对植物及环境等方面所带来的不良影响，便于对目的基因进行经济、 有效和精确地调控，因此倍受人们的关注，但迄今为止克隆的热激启动子几乎都存在表达遗 漏问题，给热澈启动子的实际应用带来了困难。奉研究克隆了拟南芥热濑基因启动子 AtHSP70b，详细分析了它在转基因烟草中的热激表，；特性，并对其序列进行了改造，获得了 的严谨性和灵敏性袁达的人工热激基因启动子HSP70m，为今后对一些目的基因进行精确的 热激调控奠定了基础。主要结果如下： 1．拟南芥热激启动子AtHSP70b的壳隆 根据拟南芥热撒启动子AtHSP70b基因序列设计两个特异性引物Priml DNA聚合酶加A碱基后，采凡{TA 通过PCR扩增出目标片段。纯化后的目标片段经Tart XLrBlue，挑取白色的重组子单菌落进行PCR筛选甫1质粒的酶切验证。委托上海生工生物工 程有限公可对阳性克隆测序。结果表明，PCR扩增的目标片段为204bp。与已发表的拟南芥 热激启动子AtHSP70b的序列一致。 2．人工热激启动于HSPTOm的设计，合成及序列测定 西南大学硕十学伊论文 将拟南芥热激启动子AtHSP70b序列中的不完善热激元件改造成完善的热檄元件 的调控区域，委托上海生工生物工程有限公司合成该片段的序列。将人工台成的HSP70m的 35S：GUS片段连接后，通过TACloning 调控区域与从psAU2006中PCR扩增得到的—46mini 挑取白色的单菌落进行PCR筛选，将检验得到的阳性重组子单菌落送上海生工测序。序列结 果与预期设计的序列一致，表明已构建成人工热激启动于HSP70m。 3．植物表达载体的构建 I+Xba I烈酶切后回收含有 质粒pMD．AtHSP／0b和pM-HSP70mGUS5分别经EeoR I+XbaI酶切后 AtHSP70b和HSP70m启动子的大片段．分别与从质粒psAU2006经EcoR I+ pVCT2020的EcoR pV-HSPT0mGUS。 4．AtHSPT0b-43US和HSFT0m-GUS基因导入烟草基因组 300ragS．Cb4-J．50mg／LFan的抗性生根培养基中，获得具有Kan抗性的烟草转基因植株·待 烟草再生苗长至5片叶左右时将移栽到营养钵中。取转基罔烟草的叶片用CTAB法提取其基 株基因组DNA能扩增出5S6bp的目标条带，与质粒阳性对照相吻合。表明日的基因 AtHSPT0b-GUS和HSP70rn-GUS已分别整合进到烟草基阏组中。 5．热激启动子AtHSP70b和人工热激启动子HSPTOm在烟草中的热激诱导表达特性分析 两种转基因的烟草植株的叶圆片在不同温度下处理．经过GUS组织化学染色后发现：在 转AtHSPT0b-GUS基因的烟草中GUS基因的表达活性随着温度的升高而增强，表明热激启 动子AtHSP70b的活性随温度的升高表达活性增强，但没有明显的温度诱导界限。 Ⅱ 中文摘要 达不严谨，存在非高温下的表达遗漏。在转HSFT0m-GUS基冈的烟草中，人工热激启动子 的升高而增强，而低于29C或高于