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Plant Tissue Culture 第九章 原生质体的培养 第九章 原生质体的培养 Disadvantages of the old model: High Costs per article $3000-5000 libraries suffer growing financial pressure (?serials crisis”) Restricted Access exclusion of a considerable part of the scientific community exclusion of a wider audience (GPs, patients, lay people, developing countries) Authors’ Rights authors must sign away copyright, therefore may not post their articles on own or institute‘s homepage, or email them to colleagues often must pay for re-use of ?their” old materials in new work, e.g. textbooks Examples of new journals published by BioMed Central (already more than 40) High visibility because auf worldwide accessability Manuscripts submitted to BMC 有些研究工作需要进行单个原生质体培养。如选择出特定的原生质体和经融合处理后数量很少的融合体等。已有实验证实，单个原生质体的单独培养的关键在于培养基原体积要特别小。如油菜单个的原生质体须培养在50ml的培养基中，这种比例相当于每毫升培养基有2X104个原生质体，在这种条件下，原生质体的再生细胞可以持续分裂直到形成愈伤组织。这样小体积的微滴，是极易蒸发的，为此，Koopt设计了一个特殊的装置：首先，在一个长度为3350um。并绝对洁净的盖玻片上滴50滴2．0mol／L蔗糖小滴，每滴1ul，分布成10行，每行的距离为3.4um。然后把盖玻片在硅溶液中浸一下，使得蔗糖小滴占领的圆点外的全部盖玻片被硅化。硅化的目的是防止以后的矿物油滴相互连通。硅化后，用水小心地把蔗糖液滴洗去，然后使盖玻片干燥并灭菌。在原来蔗糖液滴占领的圆点区域加上1um的矿物油滴，再把已悬浮有原生质体的培养液用注射器注到矿物油滴中。这样制备好的盖玻片放到一个双环培养皿中，培养皿的外环加满0.2mol／L的甘露醇溶液，最后封口。由于有矿物油并且盖玻片相当于保持在一个湿润的小室中，保证了微小培养基不会蒸发，从而可以达到单个原生质体培养的目的。 第三节 原生质体的培养 一、培养原生质体的方法 3.固液结合培养法最简便的固液结合培养方法是在培养皿的底部先铺一薄层含凝胶剂的固体培养基，再在其上进行原生质体的液体浅层培养。这样，固体培养基中的营养成分可以慢慢地向液体中释放，以补充培养物对营养的消耗，培养物所产生的一些有害物质，也会被固体部分吸收，对培养物的生长更有利。已证明这种方法对烟草和矮牵牛原生质体的再生细胞起到了促进分裂的作用。考虑到有效地吸附培养物所产生的有害物质，在下层固体培养基中添加活性炭，结果使原生质体形成细胞团的数量提高了23倍。由于很多实验已证实了琼脂糖比琼脂更适于原生质体培养，近年来又发展了琼脂糖固体培养和液体培养相结合的方法。用几种植物的原生质体做实验，发现尽管琼脂糖提高了植板率，但到细胞团阶段后就难以再继续发育。这可能是由于培养物把固体培养基中的营养耗尽所造成的。他们发展一种念珠培养法，即把含有原生质体的琼脂糖培养基切成块放到大体积的液体培养基中，并在旋转摇床上振荡以利于通气。使用大体积的液体是为了防止琼脂糖块过渡破碎。用这种方法．不仅进一步提高一些种(如番茄原生质体)的植板率，而且使一些以前从来超过细胞团阶段的种，如芜菁和矮牵牛原生质体能够持续地分裂。在水稻原生质体培养中使用的琼脂糖泡培养法也是固液结合的一个好方法。把含有原生质体的琼脂糖念球养基以大约50ul一滴，滴在直径5．5cm的培养皿中，待其固化后，再向其中添加3ml液体培养基。这样，琼脂糖滴就处于液体培养基的包围之中。在培养过程中，可以通过改变液体培养基的渗透浓度来逐渐降低固体培养基的渗透浓度，以便使培养物持续地生长发育。 第三节 原生质体的培养 一、培养原生质体的方法 第三节 原生质体的培养 二、影响原生质体培养的因素 培养机成分 渗透压稳定剂 无机