淡水鱼肌肉亮氨酸氨肽酶的分离纯化和性质的研究.pdf

淡水鱼肌肉亮氨酸氨肽酶的分离纯化与性质研究 摘 要 亮氨酸氨肽酶（leucine aminopeptidase，LAP ）是一类从肽链氮端对亮氨酸残基有最高 切割效率的氨肽酶的总称，对于鱼类及其加工品的风味和营养物质的形成有重要作用。但 目前国内外还没有关于鱼类肌肉中亮氨酸氨肽酶的报道。本文首次以鲤鱼、草鱼、鲢鱼三 种典型的淡水鱼为原料，对其肌肉亮氨酸氨肽酶进行分离纯化，并研究了它们的酶学性质， 为LAP 在鱼类肌肉中的生理学功能研究提供理论依据。 本文采用硫酸铵分级盐析、DEAE-Sephacel 离子交换层析、Sephacryl S-200 凝胶过滤 层析、羟基磷灰石层析、Phenyl Sepharose 6-Fast Flow 疏水层析和 Econo-Pac Macro-Prep High Q 离子交换层析等方法，从鲤鱼、草鱼、鲢鱼肌肉中分离纯化得到LAP ，分别命名 为cmLAP （鲤鱼），gmLAP （草鱼）和smLAP （鲢鱼）。 SDS和凝胶过滤结果表明，纯化的cmLAP 、gmLAP 和smLAP 都是单体结构， 分子量约为105 kDa。三者的最适反应温度为35-40 ℃，热稳定性较差，最适pH 为7.0-7.5 。 金属螯合剂EDTA, EGTA 和1,10-phenanthroline 能有效抑制其活性，而其它抑制剂没有明 显抑制作用，说明三者都是金属蛋白酶。Bestatin ，一种选择性抑制氨肽酶的蛋白酶抑制剂 对三者有强烈抑制作用。金属离子对三种 LAP 作用存在细微的差别，但总体看来，Mg2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 和Mn 有轻微的激活作用，Co , Cu , Zn 对酶都有不同程度的抑制作用。另外，巯基试 剂对于保持酶活性是必不可少的。除了 Leu-MCA，酶对其它很多种氨基酸残基也有一定 分解作用，而对内肽酶对应的荧光底物和大分子量天然蛋白如肌原纤维蛋白和牛血清白蛋 白没有分解作用。以 Leu-MCA 为底物，cmLAP 的K 和 V 分别为 4.6 µmol/L 和9.62 m max µmol· min- 1 · mg- 1 。以上结果表明，LAP 在所研究的淡水鱼肌肉中是普遍存在的，它们在生 物化学性质方面具有较高的相似性。 关键词：亮氨酸氨肽酶，鲤鱼，草鱼，鲢鱼，纯化 1 Purification and Characterization of Leucine Aminopeptidases from the Skeletal Muscle of Freshwater Fish Abstract Leucine aminopeptidases (LAPs), a class of cellular exoproteases preferably catalyze the hydrolysis of leucine residue from the amino-termini of proteins or peptides ，play important roles physiologically and in the formation of flavor. However, till now no report on LAP from fish muscle has been documented. In the present study, LAPs from the skeletal muscle of three typical freshwater fishes, namely common carp, grass carp and silv