《《醋酸纤维薄膜电泳》》.pptVIP

实验五 醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质 一、目的 掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白的原理和 方法 二、原理 血清中含有多种蛋白质，其等电点均低于pH7.0 在pH 8.6的缓冲液中，它们电离出负离子，带正电荷，在电场中向正极移动 各种蛋白质的等电点不同，在同一pH值下所带电荷量不同 分子的大小不同，因此在电场中的泳动速度不同，这样可将各种血清蛋白质分离开 三、实验材料及设备 1、样品：新鲜牛血清（无溶血） 2、仪器：DYY-Ⅲ2型常压电泳仪、卧式电泳槽 3、器材：醋酸纤维薄膜(8×2cm) ；点样器；培养皿； 滤纸；直尺、铅笔；镊子；剪刀；和铅笔 4、试剂：pH8.6巴比妥-巴比妥钠缓冲液 漂洗液 染色液 四、操作步骤 1、膜的润湿和选择 迎着光辨别无和有光泽面，用镊子将薄膜无光泽面向下，置巴比妥缓冲液中，自然浸泡30min 选择薄膜颜色一致而无白色斑点的膜 2、制作电桥 将电泳槽置于平台上，将缓冲液倒入电泳槽内，使两槽缓冲液平衡至同一水平面 于两电极槽各放入2层纱布，一端浸人缓冲液中，另一端贴附在电泳槽支架 当纱布全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的纱布以驱赶气泡 四、操作步骤 3、点样 点样模板的制作 取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸内吸干多余的缓冲液，无光面朝上放在点样模板上 在点样器上均匀地沾上血清，将点样器轻轻地印在点样区内 4、电泳 将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上，另一端平贴在阳极端支架上 连接好电泳仪，接通电源，调节电压为100V，电流为0.6 mA×2×n，电泳60min 四、操作步骤 5、染色与漂洗脱色 染色:电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡10min 漂洗脱色:将膜条从染色液中取出后，移置到漂洗液中，反复漂洗数次，直至背景漂净为止，可得到色带清晰的电泳图谱 五、记录和分析实验结果 把电泳图谱画在实验报告上 并指出每条区带的种类 六、注意事项 1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一 2、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸 去，吸水量以不干不湿为宜 3、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免 损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果 4、点样应点在薄膜的无光面上，点样量要适量 5、电泳时将薄膜的点样端置于负极端，且点样面 向下 6、控制染色时间 7、过程为防止指纹污染，应戴手套 七、思考题 1、电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操作？ 2、电泳时，点样端置于电场的正极还是负极？ 为什么？ 相关知识 1、电泳 带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis，EP ) 电泳是对混合物中带电离子的分离和鉴定技术 2、基本原理 电荷的来源：由于本身的解离作用或表面上吸附其它带电质点，在电场中会向一定电极移动 迁移率 ：带电颗粒在单位电场强度下的电泳速度 其泳动速度与所分离的物质所带的净电荷的数量、颗粒的大小和形状有关 3、影响电泳迁移率的因素 电场强度 溶液pH 溶液的离子强度 温度 电渗 支持物 电泳的分类 按原理分 区带电泳：在电泳过程中，不同离子成分在均一的缓冲液体系分离成独立的区带 移界电泳：是在U型管中进行的电泳 等速电泳：当电泳达到平衡后，各区带相随分出清晰的界面，并以等速移动 等点聚焦：由于不同等电点的两性电解质载体在电场中，自动形成pH梯度，使被分离物移动到各自等电点的pH处聚集成很窄的区带 电泳的分类 按有无支持物分 自电泳：在溶液中进行的一种电泳技术 区带电泳：有支持物的电泳 纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳 圆盘电由泳、平板(垂直、水平)电泳、柱电泳 什么是醋酸纤维素薄膜 醋酸纤维是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成 厚度约以0.1-0.15mm 什么是醋酸纤维素薄膜电泳 以醋酸纤维素薄膜为支持物的电泳 醋酸纤维素薄膜电泳的特点 吸附作用小，分离效果好 快速省时 灵敏度高，样品用量少 应用面广 易保存，易定量 醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱示意图 点样模板的制作 优点 微量 快速 简便 分离清晰 对样品无吸附现象 应用 广泛用于血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、血红蛋 白、酶的分离和免疫电泳等方面 血清中各种蛋白质的等电点及相对分子质量 * * 尿中17-羟皮质类固醇的测定 10 产品名称：双稳定时电泳仪 产品型号：DYY-6C型 5-600V 4-400mA 240W 卧式电泳槽 醋酸纤维薄膜电