植物组织中氨基转移反应及氨基酸的层析分离.pdfVIP

中国试剂网 3.9.263 植物组织中氨基转移反应及氨基酸的层析分离 一、目的 转氨基作用是植物界普遍存在的一种生化反应，它使蛋白质、氨基酸代谢与碳水 化合物、脂肪等代谢沟通起来，在一定程度上起平衡蛋白质、脂肪等代谢的作用。 研究植物体转氨基作用，可以使我们了解植物体不同发育阶段代谢动态的一个侧 面，从而探索控制其代谢的途径。 二、原理 通过转氨基作用，α—氨基酸上的氨基可能转移到 α—酮基的位置上，结果形成 一种新的α—酮酸和一种新的α—氨基酸。所生成的氨基酸可用纸上层析法检出。 三、仪器和试剂 1．仪器： 研 钵 恒温箱 量筒 （10 毫升） 离心机 试管 3 支 层析缸 滤 纸 吹风机 移液 管（0.5ml×3 ；2ml×1 ） 毛细管 漏 斗 离心管 2 ．试剂： （1）0.1M 丙氨酸 （2 ）0.1Mα—酮戊二酸 （NaOH 中和至pH7 ） （3 ）含有0.4M 蔗糖的0.1MpH8.0 磷酸缓冲液 （4 ）0.1M 谷氨酸、0.1—0.25%茚三酮丙酮溶液 （5 ）推动剂 （酚：水＝3 ：1 或4 ：1） 四、操作 1.酶液的制备：取发芽23 日的绿豆芽3 克（去皮），放入研钵中，加2 毫升pH8.0 磷酸缓冲液研成匀浆，转入离心管。研钵再用2 毫升缓冲液冲洗， 并入离心管， 于8000 转/分离心10 分钟，取上清液备用。 2 ．酶促反应：取三支试管，按下表分别加入试剂和酶液： 中国试剂网 3.9.263 摇匀后置试管于37℃恒温中保温30 分钟。取出后各加3 滴30%乙酸终止酶活动， 于沸水浴上加热 10 分钟，使蛋白质完全沉淀，冷却后离心或过滤、取上清液或 滤液备用。 3 ．层析：取层析滤纸一张，在距底边2 厘米处用铅笔划一水平线，在线上等距 确定5 个点，作点样位置。相邻各点相距2.5 厘米。取上述上清液或滤液及谷氨 酸、丙氨酸标准液用五支毛细玻管分别点样。反应液点56 滴，标准液点2 滴。 每点一次用吹风机吹干后再点下一次。不要点得太多，斑点直径不超过 3 ㎜为 宜（5 支毛细管勿混淆）。 在层析缸中放入酚水推动剂(3 ：1 或 4 ：1)，待缸内蒸气饱和后，将滤纸垂直放 入，展层，层析纸纸边不能迭在一起或与缸壁接触。盖好缸盖，待溶剂上升至 1015 ㎝时，小心取出滤纸用铅笔划出溶剂前沿线，用电吹风烘干。 4 ．显色：用喷雾器喷上0.1%茚三酮丙酮溶液，置烘箱(80℃)或用热吹风机加热 显色，此时可见紫色斑点。 五、结果分析 样品层析后，常用相对移动速率Rf 来表示各组分在层析谱上的位置： Rf 值与欲分离物质的性质存在一定的关系，在一定条件下是常数。从层析图谱 上鉴定α酮戊二酸和丙氨酸是否发生了转氨基反应并写出反应式。 六、注意事项 1.品不要点得太多，斑点直径不超过3 ㎜为宜。 2. 层析纸质量要好一点，否则容易弯曲，层析效果不好。层析时，且纸边不能 迭在一起或与缸壁接触。