DNA共价结合在化学修饰云母片上的AFM研究.pdfVIP

维普资讯 Vo1．24 高 等 学 校 化 学 学 报 NO．9 2003年 9月 CHEM ICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES 1621～ 1623 [研究简报] DNA共价结合在化学修饰云母片上的AFM 研究 祭美菊，侯 鹏，沈佳尧，李 松 ，陆祖宏，何农跃 (东南大学教育部分子与生物分子电子学开放实验室 ，南京 210096) 关键词 脱氧核糖核酸 (DNA)I原子力显微镜 (AFM)；共价偶联 中图分类号 O631 文献标识码 A 文章编号 0251—0790(2003)09—1621—03 原子力显微镜 (AFM)自1986年发明以来，已经成为生物学研究领域中的一个有效工具，尤其在 核酸及其它生物大分子结构方面的应用已成为普遍关注的热点．原子力显微镜要求基底达到原子级平 整，硅片和玻璃表面的起伏很大，因而原子级平整的云母具有重要的价值．一般在基片上修饰Mg抖、 Ba,-+、精胺、亚精胺、多聚赖氨酸和氨基硅烷 (APTES)等[¨，可使表面带有正电荷与DNA分子中带有 负电荷的磷酸根通过静 电作用结合[钊，但在复杂的生物化学反应过程中，被固定的DNA分子容易从 基底上脱落下来[s一．最近于力华等[‘又发展了一种新的DNA固定方法即用镍邻菲绕啉来修饰基底固 定 DNA．利用双功能修饰剂可以得到具有不同功能基团的表面，从而获得不同化学活性的基底表面． 本文应用戊二醛对云母片进行了化学修饰，使之带上具有活性的醛基，从而可与带有氨基的DNA 进行化学偶联，为DNA与核蛋 白抽提物之间的结合奠定了基础． 1 实验部分 1．1 实验材料 7_氨基丙基三乙氧硅烷 (3一Aminopropyltrimethoxysilane，APTES)购于 Sigma公司， 戊二醛 (Glutaraldehyde，GA)为南京生物工程有限公司产品，TaqDNA聚合酶为Promega产品，DNA 标准分子量 (Marker)为大连宝生生物产品，其它化学试剂均为国产分析纯． 1．2 实验方法 聚合酶链式反应 (PcR)扩增．DNA为 PCR扩增的端粒酶逆转录酶基因(TERT)启动 子区，长度为 511个碱基对 (bp)．其上游引物为 5一NH2．GTTACCCCACAGCCTAGGCCGATTC一3， 下游引物为 5-NH2．GCGGCAGCACCTCGCGGTAGT．3．．扩增条件 ：先于是 95℃预变性4min，然后 于 95℃下变性 1min，60℃退火 1min，72℃延伸 1min，经 35个循环后，用于72℃延伸 7min．PCR 产物用 QIAquickPCRpurificationkit(QIAGEN )纯化． 基底表面的修饰和表征．将新剥离的云母在 1 APTES(溶于95 乙醇)中浸泡 2Omin，用体积分 数为 95 乙醇冲洗 5次，每次 5min，然后于 110℃烘 45min．将氨基化的云母在 10mmol／L的戊二 醛 (O．01mol／L磷酸缓冲液，pH=5．5)中浸泡 4h，然后依次用磷酸缓冲液和去离子水充分漂洗 ，吹 干，置于干燥器中备用．修饰的基底表面用 Perkin—ElmerPHI5300ESCA进行表征，x射线源为 Mg Ka射线 ，强度为 250W ，所有结合能均以C—C键 (285．0eV)为基准进行校正，光电子的接收角为 45。，操作真空度低于 1．3×10一Pa． AFM 观察．将聚合酶链式反应扩增得到的两端带有氨基的DNA水溶液 (质量浓度为 0．8ng／~／L) 在37℃水浴 中保温 1h后 ，取 5 滴在修饰的云母片上，用石蜡膜覆盖将溶液展开，固定 3Omin后 用0．1 十二烷基硫酸钠水溶液漂洗 ，吹干，进行 AFM 观察． AFM (NanoseopeI，DigitalInstrument)的成像模式为轻敲模式 (Tappingmode)，在相对湿度约为 收稿 日期l2002—08—14． 基金项 目 国家重大基础研究项 目(批准号 G1998o512o4)和国家 自然科学基金 (批准号资助． 联系人简介 t何农跃 (1958年出生)，男 ，教授，博士