尿毒清胶囊人含药血清抑制尿毒症毒素血清刺激的肾小管上皮细胞2增殖与转分化作用观察.docVIP

尿毒清胶囊人含药血清抑制尿毒症毒素血清刺激的肾小管上皮细胞2增殖与转分化作用观察 　　作者：张秋林,汤水福,洪钦国　　作者单位：1广州医学院荔湾医院肾内科，广东广州510170;2广州中医药大学第一附属医院肾内科，广东广州 　　【摘要】 【目的】探讨尿毒清胶囊含药血清对人近端肾小管上皮细胞(HK2)增殖与转分化的影响。【方法】将体外培养的HK2细胞分为6组：正常对照组，体积分数5%、10%尿毒症毒素血清组(简称尿毒症血清组)，体积分数5%、10%尿毒清胶囊含药血清组(简称含药血清组)，蒙诺组(浓度为10-6 mmol/L)。采用四氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞周期和Α平滑肌肌动蛋白(ΑSMA)阳性细胞百分率。【结果】5%、10%尿毒症血清组光吸收值(D)显著高于正常对照组(均P001)。5%含药血清组D值显著低于10%尿毒症血清组(P001)，10%含药血清和蒙诺组D值显著低于5%、10%尿毒症血清组(均P001)。5%、10%尿毒症血清组G0/G1期细胞百分数(pG0/G1)显著降低(均P001),细胞增殖指数(Ip)显著升高(均P001)。5%、10%含药血清组及蒙诺组可显著升高pG0/G1，降低IP(均P001)。5%、10%尿毒症血清组HK2细胞ΑSMA阳性细胞百分率(pΑSMA阳性)显著高于正常对照组(均P001)，5%含药血清组pΑSMA阳性显著低于10%尿毒症血清组(P001)，10%含药血清组和蒙诺组pΑSMA阳性显著低于5%、10%尿毒症血清组(均P001)。【结论】尿毒清胶囊抗肾纤维化作用机制可能与其抑制参与肾纤维化的肾小管上皮细胞的增殖和转分化，进而抑制肾组织纤维化有关。 　　【关键词】 尿毒清胶囊/药理学;肾纤维化/中药疗法;血清药理学;细胞培养 　　肾纤维化是各种肾脏疾病慢性进展到肾功能衰竭的共同病理机制，而以肾间质细胞外基质沉积为主要表现的肾间质纤维化过程是影响肾功能的重要因素[1]。肾小管上皮细胞增殖、转分化在肾纤维化形成中占重要地位。尿毒症毒素血清能促进肾小管上皮细胞增殖及转分化已得到证实[2]。益气升清、通腑泄浊法组方尿毒清胶囊对5/6肾切除所致肾功能衰竭大鼠肾组织胶原沉积、转化生长因子Β1(TGFΒ1)表达具有抑制作用[3]，但对人肾间质纤维化中起重要作用的肾小管上皮细胞(HK2)增殖、转分化的作用尚未明了。本研究观察正常人的尿毒清胶囊含药血清对尿毒症毒素血清刺激的HK2增殖、转分化的影响，现将研究结果报道如下。 　　1材料与方法 　　11主要试剂与仪器RPMI1640培养基为美国Gibco公司产品，新生胎牛血清为杭州四季青生物材料工程有限公司产品，四氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、25 g/L胰蛋白酶、碘化丙啶(PI)均为美国Sigma公司产品，蒙诺(福辛普利)原药粉为美国施贵宝医药公司产品，鼠抗人Α平滑肌肌动蛋白(ΑSMA)一抗IgG2a、荧光素FITC标记山羊抗鼠IgG二抗均为德国Calbiochem 公司产品。WZEF型净化工作台为苏州净化设备厂产品，HEPA CLASS100 3131型CO2培养箱为美国Termo Electron Corporation公司产品，ALTRA型流式细胞仪为美国BECKMAN COULTER公司产品，722型紫外分光光度计为上海光学仪器厂产品，TS100型倒置显微镜为日本Nikon公司产品，DG3022A型酶标仪为美国BIOMETRA产品。 　　12培养条件采用RPMI1640培养基，临用前加体积分数20%新生牛血清、100 U/mL青霉素、100 Μg/mL链霉素。消化液为25 g/L胰蛋白酶。人近端肾小管上皮细胞(HK2)由中山大学医学院肾脏病研究所余学清教授惠赠。 　　13血清制备 　　131尿毒症毒素血清(简称尿毒症血清)收集血清肌酐在707~1 685 Μmol/L之间，近期内无明显全身及局部感染，未接受过血液透析治疗的患者血清40份，清晨空腹无菌静脉采血5 mL，室温静置2 h，无菌条件下将全部血清混匀、灭活、抽滤分装，-20 ℃保存。同期收集正常人血清，收集方法同上。 　　132尿毒清胶囊含药血清(简称含药血清)3名正常志愿者口服治疗剂量尿毒清胶囊5 d后、最后1次服药后1 h均抽血30 mL，分离血清，并将含药血清置于56℃水浴箱中30 min灭活、抽滤分装，-20 ℃保存。 　　14实验分组所有血清浓度均是体积分数。为保持培养基中血清浓度均为20%，及根据预试验和文献[2]，设定尿毒症血清和尿毒清胶囊含药血清体积分数分别为5%和10%。实验分6组