蛋白质定量测定数据分析方法.docVIP

蛋白质的定量测定数据分析方法 Preface 本方法只是个人的总结，一家之言，有问题请提出。相信广大同学自有深刻领悟！另外，由于某家实验做的不咋地，这是某家唯一的心血了-_-b，希望大家珍惜某家微薄的劳动成果。 10月24日 重订 By 周骥 Pricinples 1、实验数据分析采用Excel或Origin作最小二乘分析，相信大家都会，这就不赘述了，只是强调分析时要选用截距为0的分析，即默认分析一般为y=kx+b，其中b≠0，但此处标准曲线应选用b=0的情况，这两种分析出的k值是不同的。 (1) 对于Excel，要使所求回归值不含b项，按LINEST(Y,X,FALSE,TRUE) 设定即可，其中Y和X分别为所求对象的Y组和X组（本实验即吸光度A和蛋白浓度c）。 (2) 对于Origin，在linear fitting时选择fix intercept（固定截距），设定值为0，这样就只会给出slope（斜率）。此外，默认给出的是Adj R-Square（相关系数平方），需要开方才能得到R。目前发现，Origin8.0和Origin7.5界面有所差异，大家自己摸索一下。 2、对于Bradford法，有A=Kc（A：吸光度，c：蛋白浓度，K：吸光系数，即回归斜率），回归分析可以得到K，由此可从样品A求出c来，关键在于标准液的c的确定。 理论上，我们加入的是0~0.5ml的标准蛋白液，适量加入蒸馏水，并加入显色试剂后，体积最终为5.5ml，用UV测得的吸光度A即为此稀释后的溶液的浓度，对样品液也是一样，所以计算时应代入稀释的浓度来测算。 然而，这样计算是很繁琐的，毕竟除以5.5很难得到合适的数据。实际上，观察并进一步计算可以发现，由于显色试剂每次加入的浓度和体积是一样的，而加入前试液的体积也是一样的（0.5ml）。因为，我们是通过标准曲线求出A=Kc，只要A-c正确的一一对应即可，K值大小不影响两者关系，所以完全没有必要将显色试剂的量计入，直接用0.5ml代入计算即可。 这样，已知标准BSA浓度为250μg/ml，由加入关系可得1~5管对应的蛋白容量为c=250*V蛋白标准液/0.5，即0、50、100、150、200、250（μg/ml），从而代入A可求出合适的K。又因为样品液直接加入0.5ml样品原液，所以可得到样品原液浓度为：A样品/K。 3、上述方法同样适用于Lowry法，谭师兄所测标准曲线的横坐标即采用不考虑5.5ml显色试剂，直接用1ml试液计算的方法，由上述已知计算所得浓度恰好可以符合图中情况。而样品液中，加入样品原液0.2ml，蒸馏水0.8ml，即稀释5倍。 因而，Lowry法测算样品原液浓度为：(A样品/K)*5。 Methods 综上所述，两种方法的计算方法为： 1、Lowry）c0=(A样品/K)*5 2、Bradford）c0=A样品/K，其中，K值计算时，标准蛋白试液的浓度计算公式为：c=500*V蛋白标准液。