人造血干细胞因子克隆、表达及活性测定.pdfVIP

316 中国癌盎研究进展⑤ 人造血干细胞因子的克隆、表达及活性测定 陆爱丽王新娟扬中州黄佳鹏侯纬敏 cell 造血干细胞因子(sternfactor，SCF)是一个新近发现的细胞因子，它作用于最早阶段的 造血细胞，对早期粒系、淋巴系、红系和巨噬细胞系均有刺激生长的作用，并且表现出对其他造 的信号肽及SCF膜外区前164个氨基酸的9CF eDNA克隆，并将其插入原核表达载体pET- 了重组SCF蛋白的活性。重组的SCF具有广阔的临床应用前景，它对于一些贫血的治疗、对 于一些疾病如放化疗后造血机能的恢复，对于机体的造血和防御功能的调节以及辐射的防护 方面均有很高的应用价值【3．4J。 材料与方法 1．茼株与质粒E．co／i vagen公司，全长5．4 kb，具有多个单一酶切位点，PUCl9为本室保存。 2．酶与试剂限制性内切酶购白美国New 成：其他试剂均购自各生物技术公司。 。 3．RT-PCR扩增SCFeDNA eDNA合成试剂盒说明进行，其中5“l 人骨髓，购自美国Clontech公司。按引物设计原则设计引物，同时在两引物57端分别加上 meDNA合成产物不需纯 化即直接进行PCR，反应总体积100}d，反应条件为：95℃lmin，55℃50s，72℃1min。30个 循环后72℃延伸15rain。取10正PCR产物在1．2％琼脂糖上电泳。 4．PCR产物的回收及酶切PCR产物经PCRPrepkit回收。回收产物经BamHI酶切 37℃，3 常规操作进行。 。 盒行双脱氧末端终止反应法双向测序，引物分别为兀Jc／M13正向和反向引物。恒功率40W， 电泳时间5h。电源为HR-3000／100电泳仪(华瑞公司)。 作者单位：100083北京医科大学生物化学与分子生物学系 人造血干细胞因子的克隆、表达爰活性测定 317 SCF片段进行连接。将连接产物转化JMl09，随机挑选克隆，提取质粒，经BamHI酶切及 PCR鉴定插人情况，挑阳性质粒转化BL21(DE3)，IPTG诱导蛋白的表达。 7．蛋白的表达度纯化 将p盯-28a-SCF阳性菌落挑人LB(Kana 50tag／m1)培养基，经 37℃培养A6∞。=0．4时，加入无菌IPTG使终浓度达1mmol几。继续培养2～3h，离心收集 达。目的蛋白包涵体的分离制备按文献[41进行，再以Ni．Bind树脂亲和层析进一步纯化蛋白 后，经复性、浓缩、定量收集蛋白。 白的活性。细胞浓度1×104吼，3孔为一组，以未加任何细胞生长因子为对照，测量各孔 A59m。数值为纵坐标，生长因子浓度为横坐标做图。每孔上样量皆100“l。 结果与讨论 eDNA克隆两侧引入 1．重组质粒pET-28a-SCF的构建厦鉴定通过引物的设计，在SCF BamHI酶切位点，将SCF BamHI 田1重组质粒pET-嚣舡scF的构建 318 中国癌症研究进展⑤ BamH kb和0．6kb大小处的DNA条带，这与载体 I酶切后得到了清晰的两条对应于5．4