人乳头瘤病毒11型基因组DNA在角质形成细胞HaCaT株中的转染--抗HPV效筛选模型的基础的研究.pdfVIP

较强结合自由能的化合物，并从评分最高的100个化合物中购买到了41个，其中有两个化合物(17 论计算机虚拟筛选是一种有效的寻找先导化合物的方法，PCDGF作为该两个化合物的作用靶点及 该两个化合物作为先导化合物的可能性仍有待进一步证实。 人乳头瘤病毒n型基因组DNA在角质形成细胞IIaCl汀 株中的转染—抗脚w效筛选模型的基磕瞎I卿魂 李新宇，吴剑波，郑家润 中国医学科学院皮肤病研究所 人乳头瘤病毒(HPV)是一种嗜皮肤粘膜的双链DNA病毒，人类角质形成细胞是其天然宿主 细胞。HPV型别众多，其中HPV6型、11型是引起性传播疾病尖锐湿疣的主要病原，具有重要 的研究价值。目前HPV尚难以在体外培养条件下复制，导致对其深入研究存在困难。HaCaT细 胞是一种良性的永生化人角质形成细胞株，细胞生物学特征与正常角质形成细胞类似。有文献报 道，多种型别的HPV可在培养系统中感染HaCaT细胞。本研究选用基因克隆的HPVII全长基 因组DNA，通过脂质体介导法转染HaCaT细胞，经筛选后对HPV相关感染标志进行检测，旨 在获取能稳定携带HPVDNA的培养细胞，为HPV体外研究的深入以及进一步的药效筛选模型研 究奠定基础。 方法 将携带pBR322．HPVll质粒的大肠杆菌培养扩增，然后进行质粒的提取与纯化，并用限制性 内切酶BamHI切割下HPVll全长基因。低熔点琼脂糖回收后，用T4DNA连接酶进行线状DNA 阳性细胞克隆．将阳性克隆细胞合并与培养扩增后，用FQ-PCR技术检测细胞内HPVIIDNA的 E1^4mRNA的表达． 存在，用巢式RT-PCR技术检测HPVll 结果 化的删V11DNA存在差异。 319 均出现大批细胞死亡；继续维持培养7-10天后，以HPVll DNA／pTK-neo转染的培养：YLqj可见 到对G418抵抗的细胞克隆出现，并持续生长至2l天，而对照组细胞则全部死亡。阳性细胞克隆 合并传代后，在含半量(3418的DMEM中生长良好。 涤上清液的检测结果均为阴性(1000copy／m1)。 中可见分子量62Sbp处有特异性阳性条带，429bp处可见BIac血条带。 讨论 建立HPV的组织培养模型主要有基因转染、实验性感染与带病毒细胞直接培养等方法。基 因转染法因为实验背景明确、转染后细胞可筛选、纯化、通过基因诱变可对特定基因进行功能分 析等优点，应用最为广泛。I-IPV-6、．11等低危型在感染细胞内通常以染色体外质粒形式存在。 为了能模拟HPVllDNA在细胞内的真实状态，我们将HPVIlDNA从原核质粒载体切割下来后， 直接进行了自身环化，而不是将其重新连接于其他真核载体，这更接近于HPV感染人体时在细 胞内的自然状态。同时我们采用将HPVIlDNA与pTK-neo质粒共转染的方法以克服自身环化的 HPVllDNA缺乏可选择的显性遗传标志给转染后细胞筛选带来困难的难题。因为pTK-neo是一 种携带有新霉素耐药基因的哺乳动物细胞筛选质粒，当pTK-neo与目的基因按合适比例混和共转 染时，=者倾向于同时进入同一受染细胞。因此，通过(3418对共转染后的细胞筛选，对G418 抗药存活的细胞也即主要是携带有HPVDNA的细胞。 HPV的天然宿主细胞是人皮肤和粘膜的上皮细胞。由于原代上皮细胞传代有限，对之进行 长期的体外培养与观察存在诸多困难。HaCaT细胞是一种源于人正常皮肤角质形成细胞的永生化 细胞系，其很多细胞生物学特征均与正常角质形成细胞类似，目前已被用于多种皮肤病的体外研 究。有报道HPVII可在体外感染单层培养的HaCaT细胞中转染及在体外合适的条件下成功的诱 导分化，这些均是本研究选择HaC丑1’细胞作为转染宿主细胞的依据。 检测细胞中HPVDNA的存在与否是判定HPV转染成功最直接的方法。荧光定量PCR技术 由于可对起始模板进行准确的定量分析，在很大程度上克服了传统PCR的缺陷