高效液相色谱与基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法分析天花粉蛋白胰酶肽图谱.pdfVIP

研究论文 生命科学仪器2005第3卷／第6期 8mol／L 方法[5】取19mg天花粉蛋白，加入0．6mL Tcs含有247个氨基酸，Tcs中含有1 尿素，在lOO℃沸水中加热2min，加入0．6mL双蒸水 和o．6mL 0．4mol／LNH．CO，溶液，震荡，37qC酶解24h， 冷冻干燥。 肽段数不一定与理论值相符。 2．3．2RP—HPLc分离条件 从肽谱图看，测定了约30个肽段分子量，其中 色谱条件：色谱柱为watersc18反相柱Ms一Ⅱ 有几个肽段为胰酶自降解肽段，还有几个肽段为酶 5¨4．6cm×250mm，柱温37qc，流速0．7mⅣmin，检 测波长230nm。二元洗脱梯度为：在60min内流动相 B由5％到70％。程序结束后，色谱柱用流动相B清为胰酶自降解峰。经计算机数据库辅助分析，其中有 洗15min．每次进样体积200仙L，样品浓度为1∥L， 重复3次进样。 66．7％，匹配情况见表l。 2．2．3MALDI—TOF—Ms条件 检测条件：N2激光器，激 光波长337nm；加速电压19 。60 oso kv；基质ccA(n一氢基2，4—2 羟基肉桂酸)用50％乙腈溶 一o” …。 液饱合；1皿样品(1g·L。1水 溶液)与1uL基质混合后，滴 。，。 于不锈钢靶上，空气中自然干 …o 纵．勿池． “ 20oo 30∞ 40oo 50oo 60oo 燥后，推入离子源中测定。 t／rnin 3结果 图1 上图表示TCS酶解肽段RP—HPLC色谱图 色谱条件：色谱柱为walersCl8反相柱MS一¨5u 4 3．1 RP—HPLC法分析的 TCS肽图谱 从色谱图看，在卜．述色 谱条件下，大约有25个左右 酶解肽段得到基线分离，酶解 肽段分离是相当成功的，因 为Tcs胰酶酶解后理论肽段 数目为24，同时这也暗示 Tcs酶解相当完全而且特异 性也比较高。另外从j批 Tcs酶解肽段的色谱图谱(图 谱没有给出)，各批间的肽潜 几乎一致，各峰数目和保留 i 时间(tR)也大致相同。 3．2 MALDI—TOF—MS法分i fl 析TCS肽图谱 s i Tcs酶解肽段的谱肽图， #l 可见图2(仅测Mr=500～3 }I ；；氚；虬％赴～且。。。 500部分)，共测定30几个肽 段，各肽段的分子量(Mr)较 图2TCS胰酶酶切MALDI—TOF—Ms肽图谱 HPLc肽图谱(图1)更直观。 注：上面2图实际上为同一肽谱图，其横坐标范围为500—3500) 35 研究论文 生命科学仪器2005革3卷，第6期 表1 Tcs胰蛋白酶酶切MALDI—TOF—MS 结构之间的同一性，确认基因工程上游和下游处理过