实验三酶联免疫吸附试验.pptVIP

生物工程学院 吴海歌 定义： 利用抗体分子能与抗原分子特异性结合的特点，将游离的杂蛋白和结合于固相载体的目的蛋白分离，并利用特殊的标记物对其定性或定量分析的一种检测方法。 基本原理 三个基本原理 抗原或抗体能物理性地吸附于固相表面，并且保持其免疫活性； 抗原或抗体能与酶通过共价键形成酶结合物，同时保持各自的免疫活性和酶活性； 酶结合物与相应的抗原或抗体结合后，能通过加入底物的颜色反应来确定免疫反应的发生，颜色反应的深浅与标本中相应抗原或抗体的量成正比。 是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，再用酶标的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合物 。 96孔酶标板 包被抗原（牛血清白蛋白，BSA）； 封闭液（3%脱脂奶粉） 兔抗BSA抗体 酶标记羊抗兔IgG抗体（酶标记物）； 底物 （OPD）； 抗体稀释液（PBS）； 洗涤液（PBS-0.05%Tween 20）； 反应终止液 （2N硫酸）。 实验步骤 包被：将抗原或抗体固定在固相载体的过程称为包被。 加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。 封闭：是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。 目的：抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。 显色 　　显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。底物显色一般在室外温或37℃反应20-30分钟后即不再加深，再延长反应时间，可使本底值增高。底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入终止液终止反应。 阴性对照 (negative control) 1，不加抗原孔 2，不加一抗孔 3，不加二抗孔 阳性对照 (positive control) 采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。 在这种测定方法中有3种必要的试剂： ① 固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ② 酶标记的抗原或抗体（标记物） ③ 酶作用的底物（显色剂） 基本原理 是指酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上的抗体或抗原结合形成酶标抗原-抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值。 直接法： ELISA方法的分类 是当抗体（一抗）和包被在酶标板的抗原结合形成复合后，再以酶标二抗和复合物结合，加入酶反应底物，测定产物的吸光值 。 间接法： 夹心法： 试剂 1.抗原的处理： 2.包被抗原： 取酶标板，加入50μL/孔的抗原稀释液（5ug/孔） 37℃，放置1.5h 抗原50ug/ul 利用PBS稀释抗原500倍 1 2 3 4 A B 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 洗涤： PBS-0.05%Tween20 洗3次 4℃，放置一周 3 封闭 加入200μL/孔的3%脱脂奶粉 1 2 3 4 A B 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 37℃，放置1h 取出酶标板，甩干孔内液体 以PBS-0.05%Tween 20（200μL/孔）洗涤3次 洗涤： 4.加兔抗BSA抗体 标记各孔，加入相应液体100μL/孔 阴性 阳性 37℃，40min 1 2 3 4 A B 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 200 400 800 1600 … … … … … … … … 阴性 阴性 … … … … X X X X 抗原 + + + - 一抗 + - - - 二抗