实验七聚合酶链式反应-多态性.pptVIP

六 作 业 对该实验进行总结分析 简述PCR技术在分子遗传领域的应用 * * 实 验 聚合酶链式反应(PCR) 扩增DNA片段 一、实验目的和要求 通过本实验学习和掌握PCR基因扩增的原理和操作方法，并深刻理解PCR基因扩增技术在DNA操作中的重要性。 PCR用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。每个循环包个三个步骤，即，首先加热到94 -95℃使模板DNA变性,接着将反应液冷却到某一温度,使引物与它的靶序列发生退火,此后,退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。如此反复进行变性、退火和延伸这一循环。由于一轮扩增产物又充当下一轮扩增的模板，所以每完成一个循环，就使目的DNA产物增加一倍。 二、实验原理 PCR 反应系统的组成 PCR反应系统的组成主要包括： 模板DNA、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶、缓冲液。 要扩增模板DNA，首先要设计两条引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩增产物的两个5’末端位置。由于引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键， 因此，引物设计也就更为重要。 引 物： 引物在PCR反应中的浓度一般在0.1～1μM之间。浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异性产物。一般来说用低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完成30个循环的扩增反应，则会降低PCR的产率。 dNTP（dATP,dTTP,dCTP,dGTP） 在PCR反体系中dNTP终浓度高于50mM会抑制Taq酶的活性，使用低浓度dNTP可以减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入，高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度太低，势必降低反应物的产量。PCR常用的浓度为50～200μM，不能低于10～15μM。四种dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应。 Taq DNA聚合酶: Taq DNA聚合酶最早是从嗜热水生菌中提纯出来的。典型PCR反应混合物中，常用范围为1～4U/100μl。由于DNA模板的不同和引物不同，以及其它条件的差异，Taq DNA聚合酶的用量亦有差异，酶量过多会导致非特异产物的增加。 模 板 模板的种类：单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一条cDNA 对于模板的用量: 　　　　基因组DNA：50-100 ng 　　　 质粒DNA: 5-10 ng PCR缓冲液: 用于PCR的标准缓冲液为10～50mM的Tris –HCl缓冲液（pH8.3）和1.5mM MgCl2。 PCR循环次数 常规PCR循环次数一般为25～40个周期。一般是循环次数过多，非特异性背景严重，复杂度增加。当然循环反应的次数太少，则产率偏低。所以，在保证产物得率前提下，应尽量减少循环次数。 PCR扩增过程 在微量离心管中加入适量缓冲液、微量模板DNA、四种脱氧单核苷酸（dNTP）和耐热Taq聚合酶及两个合成DNA引物，并有Mg2+ 存在。 (1)变性阶段 加热使模板DNA在高温下（90℃-95）变性，双链解链； (2)退火阶段 降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链； (3)延伸阶段 溶液反应温度升至中温(72℃)，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链。 三. 实验仪器及材料 PCR仪、台式离心机、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统等 TaKaRa Taq (5U/ ?l) 10×PCR Buffer (Mg2+ Plus) dNTP Mixture (each 2.5 mM) 模板DNA 引物（10 ?M) 1、设计PCR反应程序 94℃预变性5 min 94℃ 1 min 55℃ 1 min 45 cycles 72℃ 2 min 72℃ 10min 4 ℃ 冷却恒定。 四、实验步骤 2、在0.2ml薄壁管中，依次加入以下各成分: ddH2O: 12.5 ?l 10×buffer（Mg2+）: 2 ?l dNTPs(2.5 mM) 2 ?l primer (10?M) :