微量中与实验-齐立.pptVIP

流感病毒微量中和实验技术 采集临床标本 采集急性期和恢复期双份血清 快速诊断 病毒分离 RT-PCR HAI 或微量中和实验 试剂盒 （MDCK 或 EGG） 测序 CPE + HA + HAI (WHO FLU H5 KIT) 微量中和实验的优势 一、传统的流感病毒中和实验主要基于对MDCK细胞病变抑制作用观察，即费时又费力。结合感染细胞快速鉴定方法，改进后的中和实验可以在两天内完成，并可一次测定大量血清样品 二、微量中和试验技术已被成功应用于检测血清中抗流感病毒甲5型抗体，并可以推广用于检测血清中其它抗禽流感病毒亚型中和抗体水平，其敏感性高于血凝抑制试验。 三、由于人群中缺乏抗禽流感病毒特异性抗体，因此，检测单份血清即可反映人群的免疫状态。但是当诊断可疑病患时，则需要同时检测急性期和恢复期双份血清中的中和抗体滴度，若恢复期血清抗体水平高于急性期（4倍）即可确立诊断。 实验原理 1抗原抗体之间的中和反应 2ELISA 的实验原理 实验材料 一 、中和反应的实验材料 （一）病毒 1）当使用甲5型病毒时，9-10日龄的SPF胚较好，一般在37℃培养26-28小时会得到较高的滴度，一般血凝滴度在128以上方可用于中和实验 2）冻存的病毒不能重复使用 3）进行中和实验前，需先进行病毒滴定（TCID50）的滴定进行病毒定量 （二）血清样品 1）收到的被检血清要分装多份，冻存于-20℃ ，一般不要反复冻融3次以上。 2）血清样品包括待检血清和阳性以及阴性对照血清，人血清实验前需56℃灭活30分钟分钟，动物血清需要RDE 处理分装，去除非特异性抑制因素。 （三）MDCK细胞和细胞培养试剂 1）MDCK细胞（狗肾上皮细胞） 早代的细胞（〈10代）以及处于对数生长期的细胞对病毒感染具有最大的敏感性（在细胞培养皿中70%-90%）成片 2）细胞培养液 DMEM 牛血清 抗生素 3）用于细胞消化的胰酶和VERSON 二 ELISA 实验材料 1, 抗体1 鼠抗流感病毒甲型核蛋白单克隆抗体 2.抗体2:辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IGG 3.洗涤液:PBS +0.05%TWEEN-20 4.封闭液:PBS +1%牛血清白蛋白+0.05%TWEEN-20 5.底物和底物溶液: 常用的辣根过氧化物酶(HRP)所用的底物为磷苯二胺(OPD) 底物溶液为PH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液 6.终止反应液 质量控制 病毒中和实验技术是一个相当复杂的过程，参与中和反应的因素有病毒、抗血清和宿主细胞，这些因素的变化都会影响中和试验的结果。因此，须对中和试验的整个过程进行严格的质量控制，每次测定必须设立阳性和阴性血清对照，阳性和阴性细胞对照，以及对病毒使用剂量进行滴定 一．??????????? 血清对照 血清对照包括人或动物血清阳性和阴性对照。即血清中含有（阳性对照）或不含有（阴性对照）对测定病毒特异性的中和抗体。血清对照一般分装成多份，-20℃保存，并避免反复冻融使用。 1．阴性血清对照 （1）??? 动物血清一般来自未免疫或未感染动物，即与待检血清同种动物的正常血清。 （2）??? 人血清一般来自与待检血清年龄相同的正常人群，该人群未暴露于待检病毒。 （3）??? 测定过程中，阴性对照血清与待检血清应处于相同稀释水平。 2．阳性血清对照 （1）??? 动物血清一般来自免疫后或感染后动物。 （2）??? 人血清一般采用急性期和恢复期双份血清做对照。 *人血清使用前须经加热灭活处理，动物血清则须经霍乱滤液RDE（即受体破坏酶）处理，以排除非特异性反应因素。 二．??????????? 病毒和细胞对照 每次试验必须设立阳性和阴性细胞对照，以及对加入病毒工作液进行滴定检查，以便获得准确可靠的实验结果。 实验步骤 该实验分为三个步骤：（1）病毒滴定（2）病毒中和试验（3）酶联免疫吸附实验