荧光分析(MFS)23.pptVIP

分子荧光分析法 1、概述 分子发光——分子吸收一定的能量跃迁到较高电子激发态，在返回基态的过程中伴随有光辐射，即分子发光。 包括：荧光(fluorescence) 磷光(phosphorescence) 化学发光(chemiluminescence) 光致发光——分子吸收光能后的发光现象 （荧光、磷光） 电致发光——分子吸收电能后的发光现象 化学发光——分子吸收化学能后的发光现象 荧光和磷光的特点： ? * ? ?及? * ? n的电子跃迁，分子必须含有不饱和官能团。 2、分子荧光分析法的基本原理 一、荧光和磷光光谱的产生 1、电子自旋状态的多重性 单重态——分子中所有电子自旋都配对的电子态。用“S”表示。 基态为单重态的分子具有最低的能量。用“S0”表示。 激发过程不伴随自旋变化，形成第一激发单重态为S1，依次为S2、S3等 三重态——分子中价电子呈自旋平行的电子态。用“T”表示。 激发过程伴随自旋变化，形成第一激发三重态为T1，依次为T2、T3等 激发单重态和激发三重态分子的性质区别 （1）S态分子具有抗磁性，磁场中无能级分裂。T态分子具有顺磁性。 （2）电子在不同多重态间的跃迁需换向，不易发生。 （3）激发单重态能量高于相应激发三重态的能量。S2T2 S1 T1S0 T1是亚稳态 （4）激发态分子平均寿命很短（10-8秒） 亚稳态分子平均寿命可达数秒钟 2、内部转换（IC）和系间窜跃（ISC） 振动弛豫——电子由较高振动能级很快（10-12s）转至同一激发态的最低振动能级。（无辐射去激过程） 内部转换（IC）——相同多重态间的无辐射去激过程。（S2?S1） 系间窜跃（ISC）——不同多重态间的无辐射去激过程。（S1 ?T1） 发光机理(Jablonski Diagram) 3、荧光和磷光光谱的产生及类型 辐射去激——处于S1或T1的最低能级的分子返回S0态时伴随的发光现象。 快速荧光——分子从S1态最低能级返回S0态各个振动能级所产生的辐射光。（10-9~10-6s内完成） stokes位移——荧光的波长总是比激发光波长长，能量比激发光小。 磷光——分子从T1态的最低能级返回S0态各个振动能级产生的辐射光。（10-4~10s） 磷光的波长比荧光更长，能量更小。 慢速荧光——分子经过系间窜跃至T1后，因相互碰撞或激活作用又回到S1态，然后再返回S0态产生的荧光。 同一物质在相同条件下产生的荧光波长相同（S1 ?S0） 二、荧光的激发光谱和荧光发射光谱 1、荧光的激发光谱 固定荧光发射波长，连续变化激发波长测得的荧光强度对波长的变化图象。峰值波长为激发波长。 2、荧光发射光谱（荧光光谱） 固定激发波长，连续变化发射波长，测得的荧光强度对波长的变化图象。峰值波长为发射波长。 发射波长总是大于激发波长。（stokes位移） 荧光光谱的特点 Stokes位移：分子荧光的发射峰相对于吸收峰位移到较长的波长. 荧光发射光谱的形状与激发波长的选择无关. 镜像规则：荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系. 荧光定量分析的基础 —荧光强度(F )与物质浓度(c)的关系 当溶液浓度很稀时（A0.05） F=KC （荧光定量分析的依据） 当A?0.05时，F与C偏离线性，F下降。 荧光与分子结构的关系 1.共轭效应 ? →?* 跃迁 芳香族化合物、五元杂环上取代苯基. 共轭体系越大,越易产生荧光,荧光效率也增大. 3,4-苯并芘 3. 取代基的作用 给电子基增强荧光： －OH,－OR,－NH2,－NHR,－NR2,－C≡N 吸电子基减弱荧光： －COOH,－C=O,－NO2,－N＝N,－Cl,－Br,－I 与?体系作用小的取代基影响不明显： －SO3R,－NH3＋,－SH,－F,－R。 取代基之间若发生氢键，增强分子平面性和刚性会加强荧光: 8.7.4 影响荧光强度的主要因素 1. 浓度：稀溶液，F∝c (?bc≤0.05) 2. 光源： F∝I0 ， 应强度大，稳定。 3、荧光光度计 一、基本装置及主要构件 1、光源 高压汞灯、氙弧灯 2、单色器 滤光片（荧光计）：只能定量测定荧光强度，不能扫描激发光谱和发射光谱。 光栅（荧光分光光度计）：即可作定量测定，也可扫描光谱。 激发光单色器的作用：从光源发射的光中