实验四醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白.pptVIP

实验三 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 实验目的 1、了解电泳技术的一般原理。 2、掌握醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白的原理和方法。 3、了解常用的蛋白分离的方法。 背景知识 电泳技术，是指在电场作用下，带电颗粒在由于所带的电荷不同以及分子大小差异而有不同的迁移行为从而彼此分离开来的一种实验技术。 带电性质决定 带电颗粒在单位电场强度下的移动速度。 μ ＝v/E=(d/t)/(V/l)=(dl)/Vt 样品本身：带电量，分子大小，形状 电场强度：电压 缓冲液：成分， pH ，离子强度 支持介质：电渗作用，吸附作用 温度 电泳技术主要用于分离各种有机物（如氨基酸、多肽、蛋白质、脂类、核苷酸、核酸等）和无机盐；也可用于分析某种物质纯度，还可用于分子量的测定。 电泳技术的优点：快速、准确、重现性好。 常见电泳类型 纸电泳 薄膜电泳 薄层电泳 凝胶电泳 等电点聚焦电泳 掌握各个电泳的原理及优缺点，进行比较。 实验原理 醋酸纤维薄膜电泳(CAME)是以醋酸纤维薄膜(CAM)作支持物的一种 区带电泳技术。醋酸纤维素薄膜是纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸 酯。该膜具有均一的泡沫状结构，渗透性强，对分子移动阻力小，厚度为120 μm 。广泛应用于医学临床中各种生物分子的分离分析中，如血清蛋白、血红蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、类固醇及同工酶等。 作为区带电泳的支持物，它具有操作简便、快速、样品需要量少，应用范围广等优点。不足之处是分辨率比聚丙烯酰胺凝胶电泳低，薄膜厚度小不适于做样品制备用。 结果示意图： 实验器具及试剂 醋酸纤维薄膜(2X8mm)；毛细管（0.9-1.1mm） ；染色皿，漂洗器， 镊子；常压电泳仪；电泳仪；水平电泳槽；粗滤纸；直尺和铅笔 小牛血清；巴比妥缓冲液（pH8.6），氨基黑10B，漂洗液（配方同书上） 实验步骤 浸泡： 用镊子取醋酸纤维薄膜放在缓冲液中浸泡20分 钟。识别出光面与毛面，并在角上做好记号。 点样： 把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干 多余的液体，然后铺在干净的平皿盖上(无光泽面 点样)，将毛细管在血清中沾一下，再在膜条一端 1cm厘米处轻轻水平地落下并随时提起，这样 即在膜条上点上了点状的血清样品。（一块膜 条可以点两个样点） 电泳： 在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面 等高，将膜条上样面平行扣于电泳槽支架的滤纸桥上。膜 条点样的一端放在负极上。通电，调节电压为160V， 记录电泳强度,电泳时间约为2.5h。 染色： 电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡5-10分 钟。 漂洗： 将膜条从染色液中取出后移置到漂洗液申漂洗数 次至无蛋白区底色脱净为止，可得到色带清晰的 电泳图谱。 透明处理、定量测定 注意事项 点样时,应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去,以免液体引起样品扩散,但不宜太干,否则样品难以进入膜内,影响分离效果. 点样时,用力不要太大,以免损坏膜片,或印出凹陷影响电泳区带分离效果. 点样量要适当,不宜过多过少. 思考？ 实验四 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 移动方向： 泳动度： 影响μ的因素： 血清蛋白中含有清蛋白、 α1球蛋白、 α2球蛋白、β－球蛋白、 γ －球蛋白等。各种蛋白质由于立体构象、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度不同。血清蛋白的PI均小于8.6，在pH=8.6的巴比妥缓冲液中，都带负电荷，电泳时向正极移动。由于迁移率不同而被分离。 pH pI pH Proten （-） Proten （0） Proten （+） γ β α2 α1 清蛋白 分子量小、等电点低的，在相同碱性PH缓冲体系中，带负电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。例如人血清蛋白在PH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。清蛋白泳动