- 1、有哪些信誉好的足球投注网站(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。。
- 2、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 3、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
- 4、该文档为VIP文档,如果想要下载,成为VIP会员后,下载免费。
- 5、成为VIP后,下载本文档将扣除1次下载权益。下载后,不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 6、成为VIP后,您将拥有八大权益,权益包括:VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 7、VIP文档为合作方或网友上传,每下载1次, 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等,对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
酶促反应动力学研究方法介绍 碱性磷酸酶km值测定 实验目的 学习环境因素对酶促反应速度的影响; 学习米氏方程及Km值得测定; 测量碱性磷酸酶km值; 实验原理 E的反应速度受到环境因素的影响,这些因素包 括底物浓度、E浓度、PH、温度、激活剂、抑止剂等 (一)米-曼氏方程式 中间产物 (二)Km与Vmax的意义 Km值 ① Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。 ② 意义: a) Km是酶的特征性常数之一; b) Km可近似表示酶对底物的亲和力; c) 同一酶对于不同底物有不同的Km值。 Vmax 定义:Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度,与酶浓度成正比。 (三)Km值与Vmax值的测定 1. 双倒数作图法(double reciprocal plot),又称为 林-贝氏(Lineweaver- Burk)作图法 酶浓度对反应速度的影响 当[S]>>[E],酶可被底物饱和的情况下,反应速度与酶浓度成正比。 关系式为:V = K3 [E] 温度对反应速度的影响 双重影响 温度升高,酶促反应速度升高;由于酶的本质是蛋白质,温度升高,可引起酶的变性,从而反应速度降低 。 碱性磷酸酶km值的测定 操作 实验数据及结果 实验讨论 Km值的定义和意义是什么? 米氏方程度表达式是什么,如何求出Vmax和Km? 现有某待测样品液5ml,将其稀释到100ml,取其稀释液1ml加入测定管按酚试剂法测其蛋白质含量,另取已知浓度的牛血清白蛋白溶液(250微克/ml)1ml加入标准管,其余操作同测定管。反应显色后测得吸光度分别为:A测=0.4,A标=0.25,求原样品液中的蛋白质含量(g/100ml) 0.8 * 酶促反应模式——中间产物学说 E + S k1 k2 k3 ES E + P 相关E学原理 ※1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式,即米-曼氏方程式,简称米氏方程式(Michaelis equation)。 [S]:底物浓度 V:不同[S]时的反应速度 Vmax:最大反应速度(maximum velocity) Km:米氏常数(Michaelis constant) V Vmax[S] Km + [S] = ── 当反应速度为最大反应速度一半时 Km值的推导 Km=[S] ∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度,单位是mol/L。 2 = Km + [S] Vmax Vmax[S] Vmax V [S] Km Vmax/2 -1/Km 1/Vmax 1/[S] 1/V Vmax[S] Km+[S] V = (林-贝氏方程) + 1/V= Km Vmax 1/Vmax 1/[S] 两边同取倒数 2. Hanes作图法 [S] [S]/V -Km Km/Vm 在林-贝氏方程基础上,两边同乘[S] [S]/V=Km/Vmax + [S]/Vmax 0 V [E] 当[S][E]时,Vmax = k3 [E] 酶浓度对反应速度的影响 最适温度 (optimum temperature): 酶促反应速度最快时的环境温度。 * 低温的应用 酶 活 性 0.5 1.0 2.0 1.5 0 10 20 30 40 50 60 温度 oC 温度对淀粉酶活性的影响 pH对反应速度的影响 最适pH (optimum pH): 酶催化活性最大时的环境pH。 0 酶 活 性 pH pH对某些酶活性的影响 胃蛋白酶 淀粉酶 胆碱酯酶 2 4 6 8 10 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 10%碳酸钠 0.1 - - - - - 碱性磷酸酶 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 酚试剂 混匀后,37℃水浴15min(准确计时) - 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 碱性磷酸酶 混匀后,37℃水浴5min 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 碱性缓冲液 - - 0.2 0.4 0.6 0.8 蒸馏水 1.0 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 2.5mM磷酸苯二钠 6 5 4 3 2 1 试剂(ml) 混匀后,37℃水浴15min,以第6管调0与650nm比色,读取各管A值。 6 5 4 3 2 1 1/ [s] [s] 1/A650 A650 管号 以上述数据双倒数作图,求出碱性磷酸酶的Km值。 *
文档评论(0)