乙酸积累对基因工程菌培养的影响及与培养基pH的关系.docVIP

乙酸积累对基因工程菌培养的影响及与培养基pH 的关系 工艺流程： a制备种子培养基 b制备种子液 c制备一号培养基 d探讨相同培养条件下低密度高密度培养乙酸对rIL-2工程菌表达的影响 e研究不同PH的培养基中乙酸对菌体生长的影响 f观察不同PH的培养基中乙酸对rIL-2工程菌表达的影响 g探讨高密度低密度培养时PH对rIL-2工程菌表达的影响。 具体流程： a制备种子培养基 LB培养基，用前加人氨苄青霉素100mg／L。 b制备种子液 —20℃甘油保存菌种，使用时取5m1种子培养基置于30ml试管中，接5ml甘油保存菌种,于30℃，1 50r／min摇床培养活化12h。300ml三角瓶装50m1种子培养基，按0.2％接种量接入活化菌种，于30℃，150r／min摇床培养8h，作为发酵罐培养和摇瓶试验的种子液。 （设计依据：在高密度培养时除乙酸外的其余因素，如营养成份不足和供氧不足等也会对菌体生长和产物表达产生影响，因而采用摇瓶低密度培养，以排除乙酸外的其它因素的干扰，此时培养过程中菌体本身分泌的乙酸可以忽略） c制备一号培养基 酵母抽提物10g/L，胰蛋白胨5g/L，NaH2PO4 35mmol/L，Na2HPO4 25mmol/L，MgSO4 8mmol/L，121℃高压灭菌,用前加50％葡萄糖溶液(8ml/L)和50mg/ml氨苄青霉素溶液(2ml/L)。 d探讨相同培养条件下低密度高密度培养乙酸对rIL-2工程菌表达的影响 ①发酵罐低密度培养：接种培养3～4h，菌体生长至OD600 0.25-0.50(2倍稀释后)后升温42℃诱导3h。 ②发酵罐高密度培养：接种后3O℃培养，菌体生长至OD600，O.45-0.60(20倍稀释后)和OD6000．25-0．30(100倍稀释后)时各补葡萄糖10g/L，并在菌密度为OD600 0.25-0.30(100倍稀释后)时，升温42℃诱导3～4h。 ③比浊法测定菌密度，比较高低密度培养时工程菌的表达水平。 （设计依据：比浊法是指悬浮颗粒在液体中造成透射光的减弱，减弱的程度与悬浮颗粒的量相关，据此可定量测定物质在溶液中呈悬浮状态时浓度的方法。④分析高密度培养时不同培养时间培养基中乙酸的含量，用电泳法对工程菌的表达水平进行测定。绘出随培养时间的延长与乙酸变化量的X-Y图，以及随时间延长工程菌的表达水平变化标准曲线图。 （设计依据：1、rlL一2表达水平测定：SDS—PAGE：电泳方法参考文献【7】，用LKB激光扫描仪对电泳条带扫描，波长633nm，扫描光束长7．2mm，宽0.4mm。测定rIL一2条带的吸光度占全菌总蛋白吸光度的百分含量。 2、培养液中乙酸测定：反相液相色谱法。色谱条件：HP1050液相色谱仪,uV检测器，波长210nm，Waters BandPark C18柱，3.9×300mm，流动相O.5％(NH4)2HPO4,pH2.6,流速lml/min。 样品预处理：1.0ml培养液8000g离心,取0．5ml上清液于5ml离心管中，加0.1ml 2.3mol/L H2SO4，O.3g NaCI,2.5ml乙醚,在振荡器上混合1min，2000g离心lmin，取上层乙醚相lml,加入0．2ml 0．1mol／L NaOH，混合lmin,2000g离心lmin,吸去上层乙醚，开盖挥发残余乙醚，放入干燥器中干燥24h,使溶液中水份和乙醚挥发完全,用0.4ml0.05mol/L磷酸二氢氨溶液溶解,10000g离心10min,取5ul上清液进样。） e研究不同PH的培养基中乙酸对菌体生长的影响 ①改变1号培养基中Na2HPO4与Na2HPO4的配比，使培养基的pH分别为6.0、6.4、6.8 、7.2、7.6、8.0、8.4和8.8。 ②在每个pH值做一组四只摇瓶，分别加入0、4、8、16g／L的乙酸，乙酸在加入前用NaOH 调至pH 与待加入的摇瓶培养基pH值相同。 ③接种后，3O℃培养，每小时取样测菌密度，连续测4h 以LnOD600对培养时间按方程lnOD600=u*t-c作直线回归，计算比生长速率，观察不同pH 的培养基中乙酸对菌体生长的影响。 f观察不同PH的培养基中乙酸对rIL-2工程菌表达的影响 ①在1号培养基中先不加磷酸盐缓冲液，接种培养3h后，分成8组，每组4只摇瓶，各组分别加入pH为6.0、6.4、6.8、7.2、7.6、8.0、8.4和8.8的磷酸盐缓冲液，使终浓度为50mmol/L。 ②每组的四个摇瓶分别加入与本组磷酸盐缓冲液pH 相同的乙酸0、2、4和8g／L 移至42℃摇床诱导3h，测rlL一2表达水平。观察不同pH的培养基中乙酸对rlL一2表达的影响。 g探讨高密度低密度培养时PH对rIL-2工程菌表达的影响 两个罐批低密度培养，