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来源 clinet 2004-5-26 1:18:00 如何正确使用聚合酶链反应技术 陶其敏 如何正确使用聚合酶链反应技术陶其敏 以紫外线照射反应体系，补骨脂素加合到核酸上，使加合了补骨脂素的DNA不能再作为模板，但仍能用于杂交。　　聚合酶链反应(polymerase chain reaction，简称PCR)又称体外酶促基因扩增。它以敏感，特异，快速的核酸分析技术而著称，是分子生物学技术的一项突破。由Mullis发明于1983年。经不断的改进，现今已发展出了不对称PCR（aeymmetri′c PCR），反向PCR（inveree PCR），多重PCR（multipex PCR），锚定PCR（anchored PCR），差异显示PCR（olol PCR），定量PCR（quantity PCR）等多种PCR技术。　　一、PCR的基本原理　　PCR模拟于DNA的自然复制过程，引物按照碱基配对与DNA模板互补结合以后，在DNA多聚酶的作用下，按照碱基配对的原则（A、T，C、G），从引物开始合成与模板DNA互补的DNA链。经变性，退火，延伸等一次循环，DNA链数量增加一倍。　　二、PCR步骤的要点　　1.高温变性：双链DNA模板在热作用下（一般在95℃），使氢链断裂，双链解离，形成单链DNA这一过程称之为变性。变性后的单链可以重新结合，形成双链，其他性质也同时复原。　　2.低温退火：模板DNA经过变性，分解为两条单链。经过系统温度降低，引物退火与互补的DNA模板结合，形成局部的双链，这也是DNA复制的起点。　　3.中温延伸：引物与模板结合后，在DNA多聚酶的作用下，从引物的5′端向3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性，退火和延伸，DNA含量即增加一倍。　　三、影响因素　　PCR的结果在上述每一个步骤中，均会受一些因素的影响。如：　　1.引物：C+G的核苷酸数应在45%～55％，以20个核苷酸为宜，如太短易出现错配，太长则易形成稳定的集合体。在一条引物内或一对引物间不应有5个以上的互补核苷酸。引物的浓度为0.1 μmol/L～1.0 μmol/L，就可完成30～35个循环的扩增，一般认为0.5 μmol/L已足够。过高浓度可能导致异位引导，可出现非靶序列的扩增。　　2.PCR缓冲液：在反应体系中不能含有高浓度的鳌合剂（如EDTA），及负电荷离子基团（PO-34）。Mg+2离子浓度要合适，它可影响引物的退火，模板和PCR中间产物的链解离，产物的特异性，引物二聚体的形成及酶活性等。Mg+2离子浓度也受DNA模板和鳌合剂的影响。　　3.Taq酶：无论市售国产或进口的，都是当前质量较好的酶。应以1～2 U为宜，如加酶过量除浪费外，还有可能导致非靶序列扩增，太低又会影响PCR产量。但在经25～30次循环以后，酶含量便成为制约反应进行的因素。此时如仍需扩增，应以产物为模板，再行第二轮扩增为好。　　4.靶序列：要以线性DNA作为模板最好。假如用质粒作反应模板，最好先将其线性化后再用。 　　5.退火温度：取决于反应体系中引物的浓度，引物长度及其核苷酸的组成，温度以比引物扩增的Tm值［（A+T）X2+（C+G）X4］低5°为宜。温度过低会增加引物与模板之间的错配现象，特异性就会下降。　　6.延伸时间和温度：Taq酶的酶活性温度可在20℃～85℃之间。但温度太低会引起非特异性扩增现象的增加，太高则会引起引物与DNA之间的变性，因此一般选用72℃。延伸时间取决于所扩增片段的长度，片段长者时间要长，短者则要短。但在最后一次循环的延伸，为使所有的产物完整，时间可以更长。　　7.循环次数：亦取决于模板的浓度。模板浓度高者，循环次数少，低者循环次数可增加。一般循环30～35次足够。此时所得产物生成速度已经接近平台期，再增加循环次数不但不能增加产量，反而引起非特异性背景产量的增加，循环次数太少则产量就降低。　　四、PCR的用途　　PCR可应用于各生物学领域：　　(1)扩增各种蛋白的基因：可用于基因重组、蛋白表达、构建cDNA文库，目前所用的基因工程生物产品，绝大多数为通过PCR方法而获得的目的基因。(2)PCR后的测序：可以很快地测出常规的PCR产物或单链的DNA序列。(3)用于分子进化和种系发育的研究，因为在一些巨大分子的序列中含有足够的进化信息，通过PCR对其编码基因的扩增，并与较近或较远的种系比较，研究其分子进化及种系发育是很有用的。(4)分析和诊断遗传性疾病，根据其基因的缺失或突变对其做出诊断。如甲型血友病、苯丙酮酸尿症、地中海贫血等有特定的遗传性基因，可以做出明确的诊断。(5)对人类HLA基因的多肽性分析，用于器官移植的配型。比原有的免疫学方法要好得多，无论在准确性及特异性，检测的速度等方